許文榮，孫瑤湘

(江蘇大學醫(yī)學院，江蘇省檢驗醫(yī)學重點實驗室，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

·述評·

外泌體內(nèi)分子標志物檢測及其臨床應用

許文榮，孫瑤湘

(江蘇大學醫(yī)學院，江蘇省檢驗醫(yī)學重點實驗室，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

外泌體(exosome)是一類可由多種細胞分泌并包裹了蛋白質(zhì)、mRNA、微小RNA(microRNA)、非編碼RNA(lncRNA)、DNA、脂質(zhì)等物質(zhì)的膜性囊泡，研究發(fā)現(xiàn)exosome在細胞間通訊、腫瘤免疫、腫瘤治療、組織損傷修復、疾病診斷中具有重要的意義。對不同來源的exosome攜帶的內(nèi)容物進行分析并篩選其特異性的分子標志物，將為相關疾病的診斷及其發(fā)生發(fā)展的研究提供非常重要的幫助。Exosome可以在血液、尿液、唾液、胸腹水、乳汁、腦脊液、肺泡灌洗液等體液中被檢出。隨著exosome分離和分析檢測技術的發(fā)展，越來越多分子標志物被發(fā)現(xiàn)，exosome內(nèi)分子標志物有望為惡性疾病的早期診斷、預后判斷提供新的依據(jù)。

外泌體；分子標志物；診斷

Exosome又稱為外泌體或胞外體，早期由多泡體(MVB)通過膜內(nèi)陷包裹內(nèi)容物形成并在多泡體與細胞膜融合的過程中被釋放到胞外,是一類粒徑為30～120 nm，內(nèi)含來源細胞中部分蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等成分的蝶形膜性囊泡[1]。Exosome可由多種細胞如造血細胞、T/B淋巴細胞、樹突狀細胞、肥大細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞及腫瘤細胞等分泌，并可在血液、尿液、唾液、胸腹水、乳汁、腦脊液、肺泡灌洗液等體液中被檢出。不同細胞內(nèi)包含的物質(zhì)各不相同，其分泌的exosome的內(nèi)容物也會存在差異，尋找exosome中組織特異性的分子標志物并比較疾病和健康狀態(tài)下的差異將在臨床疾病診斷過程中具有廣闊的應用前景[2]，本文對exosome的分子標志物分析技術及其臨床應用價值作簡要述評。

1 Exosome的提取及分子標志物檢測

Exosome常見的提取方法有超速離心法、蔗糖/碘克沙醇密度梯度離心法、商品化試劑盒ExoQuickTM、Total Exosome IsolationTM、磁珠分選法[3]等，Van Deun等[4]對前4種方法提取的exosome進行對比后發(fā)現(xiàn)蔗糖/碘克沙醇密度梯度離心法所提取的exosome蛋白質(zhì)和脂質(zhì)污染最少，磁珠分選特異性最高，但得率最低。還有學者利用多路復用微射流裝置，通過調(diào)節(jié)電壓，對表面攜帶電子的納米粒子進行捕獲，對提高exosome的純度有很大幫助[5]。在臨床應用中應根據(jù)實際情況如標本來源、數(shù)量、經(jīng)濟狀況等選擇相應的提取方法。Exosome常攜帶有膜融合蛋白(GTPases，annexins，Hotillin)、CD抗原(CD9，CD63， CD81， CD82)、熱休克蛋白(Hsc70，Hsp90)、多泡體相關蛋白(Alix，TSG101)、脂質(zhì)相關蛋白質(zhì)和磷脂、核酸等物質(zhì)。不同細胞來源exosome內(nèi)部的成分各不相同，對這些成分的檢出是進行疾病診斷的基礎。蛋白質(zhì)的檢測方法主要有SDS-PAGE凝膠電泳、二維電泳、蛋白質(zhì)芯片、免疫電鏡、LC-MS/MS等。RNA包括mRNA、non-coding RNA(microRNA，lncRNA),其檢測方法主要通過qRT-PCR、基因芯片和測序分析等。

2 Exosome的內(nèi)標志物和疾病診斷

Exosome不僅能從培養(yǎng)細胞的上清中被提取，在血液、尿液、胸腹水、腦脊液、唾液、乳汁等體液中也容易獲得。不同來源及不同生理狀況下exosome內(nèi)容物的差異提示可以將exosome作為疾病診斷的一種新方法。

2.1 血液exosome內(nèi)標志物 血液標本較好反映了一些重大疾病如腫瘤，心血管病等疾病的病理情況，傳統(tǒng)的EA，PSA，CA125，CA199等的檢測存在特異性和靈敏度不高，對疾病早期診斷及預后判斷幫助不夠等問題。許多學者努力尋找新的血清標志物，如Eichelser等[6]發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌(雌激素受體ER、孕激素受體PR和人表皮生長因子受體HER2均陰性)患者血清exosome中miR-373的表達量明顯高于乳腺腔內(nèi)乳腺癌患者，ER陰性乳腺癌患者血清exosome中miR-373水平也明顯高于ER陽性的患者，相比于腫瘤抗原更具特異性。Gotanda等[7]發(fā)現(xiàn)通過免疫沉淀反應,用人體小腸和結腸特性表達的蛋白GPA33的抗體捕獲腸道來源exosome,通過芯片篩選發(fā)現(xiàn)和乳腺癌耐藥基因BCRP呈負相關的miR-328由該exosome包裹并能反應乳腺癌細胞中miR-328的含量，為評估BCRP的表達情況并對乳腺癌耐藥及后續(xù)用藥提供指導。Kuwabara等[8]發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死和心絞痛患者血漿 exosome中 miR-1和 miR-133a的表達水平較健康人顯著升高，對心血管疾病的早期快速診斷具有重要意義。此外，約有67%惡性黑色素瘤患者血漿中分離的exosome中能檢出微囊蛋白-1，而通過傳統(tǒng)LDH監(jiān)測，陽性率只有7%[9]。食管鱗狀細胞癌患者血清中exosome包含的miR-21水平高于良性食管腫瘤，且其表達水平的高低與腫瘤的分期及淋巴結轉(zhuǎn)移相關[10]。結腸癌患者血清exosome中的let-7a、miR-1229、miR-1246、 miR-150、miR-21、miR-223及miR-23a表達量遠高于非腫瘤患者和已進行腫瘤切除術的患者[11]。血清exosome中miR-629、miR-100和miR-154-3p則可以用于區(qū)分肺腺癌和肉芽腫。Stern等[12]通過比較78例運動員和16例非運動員血漿exosome中的tau蛋白含量，結果顯示運動員組比非運動員組的exosome所含tau蛋白量更高，其特異性100%，靈敏度達83%。此外，tau蛋白含量越高，受試者記憶力檢測的成績越差，檢測血漿exosome中tau樣蛋白可以判斷是否有過腦部外傷史，為慢性創(chuàng)傷性腦部傷的診斷和預后提供幫助。雖然血漿、血清標本中分子標志物直接檢測與分析更為方便，但是，有些血清標志物如microRNA在exosome內(nèi)含量更豐富且不易降解，因此，比較這兩者的臨床應用價值并選擇更合適的檢測方法用來指導臨床疾病診斷值得引起更多關注。

2.2 尿液exosome內(nèi)標志物 尿液標本常用于泌尿系統(tǒng)感染及腎臟功能檢測，但由于外界環(huán)境因素,標本容易變質(zhì)，常對檢測結果影響較大。尿液取材容易且含有相對于細胞和尿蛋白來說性質(zhì)更穩(wěn)定的exosome，給泌尿系統(tǒng)疾病的檢測提供了更好的手段。Ichii等[13]發(fā)現(xiàn)自身免疫性腎小球腎炎(AGS)患者尿液exosome中miR-26a含量增加。Abdeen等[14]發(fā)現(xiàn)用慶大霉素對大鼠進行腹腔注射誘導形成腎損傷，5 d后血漿肌酐升高，第7天出現(xiàn)多尿和尿比重失調(diào)現(xiàn)象,而由腎小球集合管通過exosome分泌到尿液中的水通道蛋白AQP2在腎損傷第1天即可檢測到明顯增高，到第7天才下降，其變化早于機體腎功能紊亂癥狀的出現(xiàn)。Spanu等[15]也發(fā)現(xiàn)氨基核苷嘌呤霉素誘導形成大鼠腎損傷，和正常組比較，第5天損傷組尿液exosome中的胱抑素mRNA表達量增高7.5倍。尿液exosome對前列腺癌的診斷具有指導意義，前列腺抗原(PSA)作為臨床診斷前列腺癌的標志物已經(jīng)30多年，而其敏感性和特異性并不能滿足診斷需求，尿液exosome中生物學標志物的聯(lián)合檢測可能幫助醫(yī)護人員和患者走出這一困境，Neeb等[16]發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者尿液exosome中AGR2(主要由腺體分泌)的剪接體SV-G 和 SV-H表達量和良性腫瘤患者存在區(qū)別，且ROC曲線遠優(yōu)于檢測血清PSA含量。Wang等[17]通過聚丙烯酰氨凝膠電泳及ELISA等方法檢測到Flotillin2、Rab3B、LAMTOR1等蛋白在前列腺癌患者尿液exosome中表達量明顯高于健康人，且特異性可達90%以上。因此，尿液exosome不僅能用于泌尿系統(tǒng)感染的診斷，還可能在無創(chuàng)情況下為其他疾病的早期診斷提供幫助。

2.3 腦脊液exosome內(nèi)標志物 腦脊液是目前能夠微創(chuàng)獲取的最能反應神經(jīng)系統(tǒng)狀況的標本，研究發(fā)現(xiàn)腦脊液中也能提取exosome。Goetzl等[18]發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病患者(AD)exosome中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運受體如受體相關蛋白6(LRP6)、熱休克因子-1(HSF1)、抑制因素1(REST)明顯低于健康人，揭示了AD患者神經(jīng)退行性變化的原因，是一個預測AD進展的指標。Fiandaca等[19]發(fā)現(xiàn)AD腦脊液exosome中磷酸化tau蛋白含量上調(diào)，反映了病情進展及預后。Exosome在帕金森病和亨廷頓舞蹈癥的診斷中具有重要作用，帕金森病患者腦脊液exosome含有的α-synuclein、 LRRK2等蛋白是導致β-amyloid前體生成的重要蛋白質(zhì)，若能對exosome中該蛋白質(zhì)的含量進行分析是預測帕金森病進展的重要手段。對于AD和帕金森病的鑒別，Gui等[20]提出通過比較腦脊液exosome所含的microRNA含量，可以為該2種疾病更精確的診斷提供幫助。此外通過檢測exosome分泌的亨廷頓蛋白也是預測亨廷頓舞蹈癥的途徑，為后續(xù)的治療提供幫助[21-22]。exosome分子標志物將為神經(jīng)方面疾病的研究和治療提供新的實驗室資料和依據(jù)。

2.4 腹水exosome內(nèi)標志物 腹腔積液常見于腹部器官的病變?nèi)绺斡不?、肝癌、卵巢癌、結腸癌等。Vaksman等[23]提出卵巢癌患者腹腔積液exosome中miRNA-21、23b、29a高表達常意味著高死亡率，而結腸癌患者腹水分離的exosome中claudin-3水平明顯高于健康人對照[24]。Tokuhisa等[25]通過檢測胃癌切除術患者腹腔灌洗液，胃癌轉(zhuǎn)移瘤分離株培養(yǎng)上清，及胃癌卵巢轉(zhuǎn)移患者腹腔灌洗液發(fā)現(xiàn)miR-21和 miR-1225-5p在胃癌轉(zhuǎn)移標本中的表達量明顯升高，這可能為胃癌侵犯腹腔及相關器官早期檢測提供幫助。腹水中含有大量的蛋白質(zhì)和核酸，腹部器官眾多，這些物質(zhì)的來源難以確定，僅從游離蛋白質(zhì)核酸分析診斷疾病有一定的難度，而exosome具有組織特異性，在腫瘤組織的定位上更具優(yōu)勢，診斷的精準度也會更高。除了以上體液，唾液、肺泡灌洗液、卵泡液中也發(fā)現(xiàn)了exosome，在腫瘤、生殖功能、呼吸功能的診斷中顯示其意義[26]。

3 其他及小結

Exosome作為一類能攜帶多種有生物學活性物質(zhì)的膜性囊泡，在腫瘤、心血管疾病、感染性疾病等的研究中頗受關注。Exosome參與了細胞間信號傳導，調(diào)控了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，對腫瘤免疫、耐藥、預后有著重要的作用。

2型糖尿病患者血漿中攜帶CD41a、CD144/CD31、CD31/annexin V表面標志的exosome數(shù)量越多，預示合并產(chǎn)生動脈粥樣硬化的可能性越大[27]。乳腺癌患者血漿exosome中的miR-141和 miR-195等指標對相應疾病的診斷有幫助。除了蛋白質(zhì)、RNA、exosome內(nèi)基因組DNA也具有腫瘤的診斷作用。Kahlert等[28]在胰腺癌患者血清exosome中檢測到KRAS和p53的突變體，對胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展起到指示作用。Exosome中也發(fā)現(xiàn)了lncRNA的存在，其在疾病診斷中作用目前報道極少，是否有診斷意義還需進一步研究。近期,Jin等[29]對極端物理環(huán)境處理下的血清exosome的內(nèi)容物進行檢測，發(fā)現(xiàn)其穩(wěn)定性能很好地滿足相關指標的檢測，進一步為exosome用于疾病診斷打下了堅實的基礎。Tavoosidana等[30]發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者外周血中前列腺腺泡分泌的exosome含量和腫瘤惡性程度相關，且其含量越高，Gleason評分越高，預示前列腺癌惡性度越高。由此可見，exosome的濃度和內(nèi)容物都可以為臨床診斷提供幫助。分析exosome中蛋白質(zhì)、RNA、DNA的組成可以確定其組織來源，進而分析疾病和健康狀態(tài)下其他指標的差異就可以尋找到診斷的分子標志物。因此，通過提取體液中exosome作為診斷手段比單純檢測體液中游離的一些生物學指標更具特異性和敏感性。Exosome預示著細胞的病變，遠早于組織和器官病變，對疾病早期診斷，分析良惡性，降低誤診率及減少侵入性檢查的風險有意義。商品化試劑盒的出現(xiàn)使exosome的提取更加便捷，此外,尿液exosome的提取可以通過無須超速離心的方法，直接用特殊的濾膜即可將exosome吸附并對其進行后續(xù)分析[31]，而Khosravi 等[32]設計的微陣列可以直接捕獲體液中的exosome，可能極大地推動微創(chuàng)診斷惡性疾病的進展。先進的提取技術及越來越多分子標志物的發(fā)現(xiàn)，會使exosome在疾病診斷領域的潛能越來越清晰，為惡性疾病的早診斷、早治療、及預后判斷開啟新的篇章。

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(本文編輯：許曉蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.03.01

許文榮，1963年生，男，教授，博士研究生導師，主要從事干細胞與腫瘤分子診斷研究，E-mail:icls@ujs.edu.cn。

R446.1

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2016-10-17)