(泰州學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

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溶菌酶的分離方法及進(jìn)展

宋娟

(泰州學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

溶菌酶是一種生物酶，可選擇性地分解微生物的細(xì)胞壁。作為一種天然安全的殺菌劑、防腐劑，溶菌酶在醫(yī)藥、食品行業(yè)、飼料工業(yè)得以廣泛的應(yīng)用。本文綜述了溶菌酶生產(chǎn)工藝中各種分離方法及其進(jìn)展，對未來溶菌酶的分離純化進(jìn)行了展望。

溶菌酶 ； 分離 ； 純化

Keywords:lysozyme ； separation ； purification

溶菌酶又稱胞壁質(zhì)酶，是一種專門作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，廣泛存在于人和高等動物的組織、分泌物及體液中，鳥類和家禽的蛋清以及微生物中也含此酶，其中以新鮮雞蛋清中含量最為豐富[1]。溶菌酶本身無毒，它可以在不破壞其他組織的前提下，選擇性地分解微生物的細(xì)胞壁。這一特性使其成為一種天然安全的殺菌劑、防腐劑，在醫(yī)藥、食品行業(yè)、飼料工業(yè)得以廣泛的應(yīng)用[2-7]。此外，溶菌酶還可以被用作基因工程和細(xì)胞工程中細(xì)胞融合操作必不可少的工具酶，應(yīng)用價值極高[8]。近年來，隨著生物分離技術(shù)的不斷推陳出新，溶菌酶分離純化的方法也愈來愈多，從傳統(tǒng)的結(jié)晶法到離子交換法和色譜法，再到后來的新技術(shù)如膜分離技術(shù)、超濾法和親和—膜過濾技術(shù)等[9]。本文就近年來常用的一些分離純化方法進(jìn)行綜述。

1 分離純化方法

1.1結(jié)晶法

結(jié)晶法是制備溶菌酶晶體最傳統(tǒng)的一種方法，1937年MayerAbraham等獲得結(jié)晶溶菌酶之后，Alderton等[10]在1945年提出了直接結(jié)晶法。該法根據(jù)溶菌酶耐熱、耐酸，在鹽溶液中易溶且穩(wěn)定性好的特性，加入中性鹽使其溶解。然后利用溶菌酶和其他物質(zhì)等電點的差異，調(diào)節(jié)溶液的pH值使其析出。結(jié)晶法操作簡單但生產(chǎn)周期長，雖然經(jīng)過重結(jié)晶可得到高純度的溶菌酶，不過原料損耗相對較大，產(chǎn)率一般為60%～80%。楊景芝等[11]對傳統(tǒng)方法進(jìn)行改進(jìn)，在加入中性鹽之前用724樹脂進(jìn)行吸附，隨后將洗脫液進(jìn)行鹽析，透析后調(diào)整透析液pH值，二次調(diào)整其pH值，加入磷酸緩沖溶液，最后離心去除雜質(zhì)得到純化液。經(jīng)過改進(jìn)，從雞蛋清中提取溶菌酶的產(chǎn)率提高，并且活性增加。因為結(jié)晶法要求溶菌酶的含量相對較高，對于微量的溶菌酶分離效果較差，所以目前除了蛋清，其他來源的溶菌酶分離純化一般不采用結(jié)晶法。

1.2離子交換法

離子交換法一直是分離純化溶菌酶常用的方法，是利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)合力的差異來分離純化物質(zhì)的一種方法。因為溶菌酶為堿性蛋白質(zhì)，最適宜酸度pH值為6.5，故可利用弱酸型陽離子交換樹脂對其進(jìn)行分離，然后再用氯化鈉或硫酸銨溶液洗脫，達(dá)到分離的目的。該法簡便、高效、成本低，可實現(xiàn)自動化連續(xù)操作。常用的離子交換劑有Duolite-464、羧酸纖維素(PC)、羧甲基纖維素(CMC)和羧甲基瓊脂糖等[12]。李蓉等[13]選擇硅膠基質(zhì)交換柱，建立了比傳統(tǒng)的軟基質(zhì)離子交換分離速度快、純化效率高的新方法。將蛋清樣品勻漿后，用NaCl初步純化，然后用硅膠基質(zhì)弱陽離子交換柱XIDACE-WCX分離，溶菌酶純化倍數(shù)提高了5.6倍。溶菌酶活性回收率為107%，蛋白的比活為15 467 U/mg。余海芬等[14]探索出一種高收率、高活性的雞蛋清溶菌酶提取技術(shù)，選用D152陽離子交換樹脂，確定了最佳提取條件，得率為2.95 mg/mL，比活為9 500 U/mg左右，純度為96.3%。趙林等[15]將蛋清稀釋后先利用等電點沉淀去除部分雜質(zhì)，然后利用快流速羧甲基—瓊脂糖凝膠柱層析進(jìn)行純化。得到的溶菌酶純度達(dá)到95%以上，比活達(dá)到17 600 U/mg，收率達(dá)到4.2 mg/mL，比余海芬等收率高約42.4%，比活也提高很多，高效快速地完成了蛋清溶菌酶的純化。離子交換法提取分離蛋清中溶菌酶，設(shè)備簡單成本低，操作方便周期短，且所得溶菌酶活力和收率較高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

1.3色譜法

色譜法以親和力為基礎(chǔ)，制備具有特異親和性的分離介質(zhì)，選擇性地吸附生物活性物質(zhì)，再依據(jù)待分離物質(zhì)的特性選擇適合的溶液洗脫而達(dá)到分離的目的，其中以20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的親和色譜技術(shù)應(yīng)用最廣。親和色譜又稱為親和層析法，是根據(jù)酶與作用底物的特異性親和能力，利用酶分子獨有的專一性結(jié)合位點或結(jié)構(gòu)性質(zhì)的分離方法，它的選擇性好、高效快速，能夠滿足蛋清溶菌酶高效分離與純化的需要。HeL Z等[16]采用多步親和層析法分離純化溶菌酶，結(jié)果表明，利用三步親和層析系統(tǒng)對溶菌酶進(jìn)行純化，可以將產(chǎn)率從一步法的61%提高到96%。王建山等[17]利用一種新型的強陽離子交換/疏水色譜(SCX/HIC)雙功能色譜柱構(gòu)建了在線單柱二維液相色譜(2DLC-1C)，利用在線2DLC-1C技術(shù)在70 min內(nèi)完成了對雞蛋清中溶菌酶、卵清蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白三種活性蛋白的快速分離純化，其純度分別為95%、93%和97%。該分離系統(tǒng)實現(xiàn)了自動控制，操作簡單，易于放大，純化速度快，有望廣泛應(yīng)用于活性蛋白的快速分離制備和工業(yè)化生產(chǎn)。

1.4膜分離技術(shù)

膜處理技術(shù)是指在一定的驅(qū)動力下，使溶液通過一定孔徑的膜，達(dá)到濃縮溶質(zhì)或凈化溶劑的效果，通稱為膜分離技術(shù)。工業(yè)化的膜分離過程主要有：微濾、超濾、反滲透、滲析、電滲析、氣體分離和滲透汽化。近來，研發(fā)人員以傳統(tǒng)的膜處理為基礎(chǔ)，將親和配基結(jié)合在分離膜上，利用親和配基與目標(biāo)分子進(jìn)行特異性結(jié)合，雜質(zhì)則大部分透過膜孔流出，通過洗滌除去膜上殘留的雜質(zhì)，然后將目標(biāo)分子從膜上洗脫下來。它具有耗時短、反應(yīng)溫和、純化效率高等特點，可作為分離、純化DNA和蛋白質(zhì)等生物大分子的新型技術(shù)手段，現(xiàn)已廣泛運用。李靜等[18]用金屬螯合物作為配基的親和膜分離純化溶菌酶，實驗結(jié)果表明，親和膜對溶菌酶的選擇吸附性能良好，可以用親和膜直接從蛋清(殼)中分離提純?nèi)芫?，純度達(dá)17 500 U/mg。Bayramoglu G等[19]采用一種新型親和染料—配基復(fù)合膜對溶菌酶的吸附及動力學(xué)特征進(jìn)行了研究。他們還將活性綠19固定在甲基丙烯酸羥乙酯殼聚糖復(fù)合膜上，使得溶菌酶在上面的吸附量相比于普通復(fù)合膜的提高了9倍[20]。

1.5超濾法

超濾是一種新興的分離純化物質(zhì)的技術(shù)，它以壓力為動力，利用超濾膜不同孔徑對液體進(jìn)行分離的物理篩分過程，具有產(chǎn)品得率高、雜質(zhì)少、純度高等優(yōu)點，一般應(yīng)用在反滲析和濃縮等方面，近來也在蛋白質(zhì)的分離純化中得到越來越多的應(yīng)用。在無菌條件下操作，可以直接生產(chǎn)無菌的溶菌酶溶液，直接用于臨床治療[21]。如果在原料液中加入親和載體，再與傳統(tǒng)超濾技術(shù)相結(jié)合，而實現(xiàn)特異性分離目標(biāo)產(chǎn)物的技術(shù)叫作親和—膜過濾技術(shù)。這項技術(shù)由Medda于1981年首次提出，它是首先利用相對分子質(zhì)量較高的水溶性分子化合物為載體基質(zhì)，在基質(zhì)上耦連一定量能夠特異性結(jié)合目標(biāo)分子的親和配基以獲得親和載體[22]。再利用親和載體親和吸附目標(biāo)蛋白質(zhì)分子結(jié)合形成大分子復(fù)合物，通過超濾膜進(jìn)行超濾分離。此時超濾膜可以完全截留大分子復(fù)合物，而雜質(zhì)分子則透過濾膜，接著用洗脫液解吸大分子復(fù)合物，使親和載體和目標(biāo)分子分離后再次通過超濾膜。這次大分子親和載體將被截留，而目標(biāo)蛋白質(zhì)分子則通過濾膜得以純化[23]。陳萍等[24]以200 kDa的水溶性葡聚糖為基質(zhì)，Cu2+做親和配基的大分子水溶性葡聚糖親和—超濾載體對溶菌酶的吸附分離特性。結(jié)果表明親和—超濾載體與溶菌酶的吸附能夠在短時間內(nèi)達(dá)到吸附平衡，擬合最大理論吸附量為13.65 mg/g，親和—超濾載體有良好的重復(fù)使用特性，且平均洗脫率約達(dá)92%。

2 展望

溶菌酶由于其廣泛用途，成為生化領(lǐng)域研究的熱點，而溶菌酶的分離與純化方法更是研究的重點。目前因為雞蛋清中溶菌酶的含量較高，國內(nèi)外主要從雞蛋清中提取溶菌酶，但是，即使在雞蛋清中的溶菌酶含量較高，也相當(dāng)有限。為了滿足人們對溶菌酶越來越大的需求，探討高效的溶菌酶分離技術(shù)，提高溶菌酶生產(chǎn)質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本，適應(yīng)各種應(yīng)用的需求，勢在必行。單一分離純化方法往往存在純度不高、回收率低和自動化難以實現(xiàn)的問題，因此需要建立多階段復(fù)合的分離純化體系，再結(jié)合基因工程及蛋白質(zhì)工程，建立重組溶菌酶的微生物表達(dá)系統(tǒng)，獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)出高活性溶菌酶的高產(chǎn)表達(dá)菌株，來提高溶菌酶產(chǎn)量和效率滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求。

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SeparationMethodsandProgressofLysozyme

SONGJuan

(Taizhou University，Taizhou 225300 , China)

Lysozyme is a kind of biological enzyme,which can selectively decompose cell wall of microorganisms.As a kind of natural and safe baltericide and antiseptic,lysozyme is widely used in medicine,food industry and feed industry.In this paper,the separation methods and progress of lysozyme production are reviewed.The separation and purification of lysozyme in the future is prospected.

2017-04-10

宋 娟(1977-)，女，副教授，從事應(yīng)用化學(xué)方面的工作，電話：13912193222。

TQ426.9

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：1003-3467(2017)07-0016-03