劉宗諭，李 丹，王碧航，范麗梅*

(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長春130041)

重樓皂苷抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)其凋亡分子機(jī)制研究

劉宗諭1，李 丹2，王碧航2，范麗梅2*

(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長春130041)

卵巢癌近年來在婦科門診和病房中發(fā)病率逐漸增多，屬于女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，病死率極高，嚴(yán)重危害了患者身體健康和生存質(zhì)量。目前國內(nèi)對(duì)卵巢惡性腫瘤的治療主要還是以化療、手術(shù)切除為主，研究顯示，化療的藥物治療效果和所用劑量呈正比[1]。但是，長期化療，劑量在體內(nèi)不斷累積會(huì)導(dǎo)致較嚴(yán)重的不良反應(yīng)，嚴(yán)重的患者可出現(xiàn)過敏性休克、心血管系統(tǒng)和骨髓造血系統(tǒng)均受到嚴(yán)重影響，一般不良反應(yīng)即脫發(fā)、骨骼肌肉酸痛以及胃腸道反應(yīng)等[2]。因此，臨床許多專家學(xué)者對(duì)于卵巢癌治療手段已經(jīng)從傳統(tǒng)方法逐漸研究、實(shí)驗(yàn)、開拓到使用天然物質(zhì)中提取無副作用或者不良反應(yīng)很輕微的有效成分來對(duì)抗惡性腫瘤，本文主要探討從天然中藥材中提取的物質(zhì)作用于卵巢癌細(xì)胞的機(jī)制，分析其對(duì)抗惡性腫瘤的臨床效果，總結(jié)其濃度與癌細(xì)胞作用時(shí)間的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次實(shí)驗(yàn)所用的實(shí)驗(yàn)材料有人乳頭狀漿液性卵巢癌細(xì)胞，來自于我省腫瘤醫(yī)院研究所提供[3]；實(shí)驗(yàn)藥品有重樓皂苷Ⅰ粉劑(中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)，批號(hào)111590-200402)。用DMSO(二甲基亞砜)助溶，配成高濃度原液(100 μg/μL)，-20～20℃保存。工作液濃度按實(shí)驗(yàn)需要臨用前用RPMI1640培養(yǎng)液配制，其中DMSO終濃度小于0.5%；實(shí)驗(yàn)試劑HyClon RPMI1640培養(yǎng)基；HyClon胎牛血清；Cell Counting Kit-8(日本同仁化學(xué)研究所生產(chǎn)；Cycle Test PlusrTM DNA Reagent Kit (Becton Dickinson公司)；FITC Annexin V Apoptosis Detection kit(BD Pharmingen公司)；Hoechst33258染色試劑(碧云天生物技術(shù)有限公司)；實(shí)驗(yàn)設(shè)備與儀器是奧林帕斯倒置顯微鏡(日本Olympus IMT-2-21)；全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國Bioscience Nexcelom公司)；酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；流式細(xì)胞儀(BD FRCS Calihur)；熒光顯微鏡(尼康Ti一E倒置顯微鏡)[4]。

1.2 方法

將重樓皂苷按照不同濃度分為4組，每組濃度間隔為1 μg/ml，接種到平板中，細(xì)胞需在常溫下保存，在CO2分壓為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞增殖抑制率公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率；細(xì)胞周期在重樓皂苷影響的實(shí)驗(yàn)方法也是建立4個(gè)不同的濃度梯度，間隔同上，記錄24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值，將30萬細(xì)胞為單位接種到1640培養(yǎng)液中，在CO2分壓為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，24 h后將細(xì)胞收集并且逐漸加入70%的酒精來將細(xì)胞進(jìn)行固定，固定好后置入冰箱備用，冰箱溫度為4℃，待第二天取出固定好的細(xì)胞100 μl，離心5 min，去除上清液和酒精；濃度梯度分組同上，采用PI染色法染色，在光鏡下檢測凋亡細(xì)胞，接種培養(yǎng)基的細(xì)胞單位為50萬，同樣條件下培養(yǎng)細(xì)胞，收集3 h和6 h的細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0對(duì)所得資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用單因素方差分析，各組比較P<0.05表示有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制曲線所得重樓皂苷I的半數(shù)抑制濃度(IC50)：24 h、48 h、72 h、分別為3.38 μg/mL、1.29 μg/mL、1.17 μg/mL，集中在1-3.5 μg/mL之間；當(dāng)重樓皂苷作用于卵巢癌細(xì)胞不同時(shí)相的結(jié)果間比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，詳見表1、表2、表3。

重樓皂苷Ⅰ作用癌細(xì)胞3 h便可以誘導(dǎo)其進(jìn)行早期凋亡，6 h后可顯著誘導(dǎo)，凋亡率分別為30.67%和38.72%，兩組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，高濃度組即3 μg/ml組的凋亡率則有所下降。

表1 不同濃度梯度的重樓皂苷Ⅰ對(duì)卵巢癌細(xì)胞24 h 周期性影響分析

注：與對(duì)照組比較P<0.05

表2 不同濃度梯度的重樓皂苷Ⅰ對(duì)卵巢癌細(xì)胞48 h 周期性影響分析

注：與對(duì)照組比較P<0.05

表3 不同濃度梯度的重樓皂苷Ⅰ對(duì)卵巢癌細(xì)胞72 h 周期性影響分析

注：與對(duì)照組比較P<0.05

3 討論

重樓屬于百合科或七葉一枝花根莖，中醫(yī)認(rèn)為其藥效具有清熱解毒[5]、消腫止痛、涼肝定驚的功效，西醫(yī)范疇解釋其具有免疫調(diào)節(jié)、止血抗腫瘤等藥效作用。甾體皂苷是重樓的主要化學(xué)成分，所占比例為80%[6]，是抗癌細(xì)胞的有效成分，近年來已經(jīng)有許多學(xué)者經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了重樓皂苷及其提取物有對(duì)抗惡性腫瘤的作用[7]。國外學(xué)者報(bào)道了關(guān)于15種中藥的乙醇提取物和水的提取物對(duì)癌細(xì)胞的抗腫瘤包括了肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞以及食管腺癌細(xì)胞[8]，胃癌細(xì)胞體外的抑制作用較為明顯，通過小鼠模型的實(shí)驗(yàn)證明了無論體外還是體內(nèi)，重樓皂苷均有很強(qiáng)的抗肺癌作用。

本研究是提取了重樓皂苷Ⅰ，分析其對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抗癌作用效果，按照不同濃度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，結(jié)果顯示出重樓皂苷提取物對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用較為明顯，而當(dāng)提取物劑量較低時(shí)，抑制的效果較差，在濃度劑量為1 μg/ml的時(shí)候，抑制率顯著增加，并隨濃度升高而升高，二者存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，這與以往報(bào)道相一致[9]。傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物多為周期特異性，機(jī)理主要是干擾細(xì)胞的有絲分裂和增殖，達(dá)到抑制腫瘤生長的目的，文獻(xiàn)報(bào)道表示[10]，重樓提取液對(duì)人的結(jié)腸癌細(xì)胞增殖作用24 h以后，S期的分布比例上升，而G0/G1期比例下降、G2/M期的細(xì)胞分布增加，這一現(xiàn)象說明了重樓提取液可能是抑制了癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)和DNA的合成達(dá)到抑制生長和增殖的目的[11]，當(dāng)作用了48 h以后，G0/G1期細(xì)胞比例開始顯著減少，S期和G2/M期的細(xì)胞分布是增加狀態(tài)，這一結(jié)果說明了期干擾DNA合成是在前期。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡也是抗腫瘤的機(jī)制之一，國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[12]，重樓皂苷Ⅰ作用于卵巢癌的裸鼠模型時(shí)，主要以線粒體途徑來完成誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抑制癌性生長的目的，本次試驗(yàn)結(jié)果和裸鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致[13]，但是本次結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃度較高時(shí)，細(xì)胞的凋亡率并不高，這可能與細(xì)胞直接殺傷有關(guān)[15]。

綜上所述，重樓皂苷Ⅰ對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生長有顯著的抑制作用，各濃度梯度效果不同，可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對(duì)抗癌細(xì)胞的生長，為臨床治療提供科學(xué)的理論依據(jù)。

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吉林省產(chǎn)業(yè)技術(shù)與開發(fā)項(xiàng)目(2013C026-4)

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2016-09-28)

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