劉丹丹，謝麗敏，馮延靜，李錦毅，王向黨

全反式維A酸對胃癌干細胞相關(guān)基因CD133、Sox2及GSK3B表達的影響

劉丹丹1，2，謝麗敏2，馮延靜2，李錦毅1，王向黨3

目的 探討全反式維A酸(all-trans retinoic acid,ATRA)對胃癌干細胞相關(guān)基因CD133、Sox2及GSK3B表達的影響，為胃癌治療提供新的切入點。方法 建立人胃癌裸鼠移植瘤模型，分為對照組、氟尿嘧啶組、ATRA組、氟尿嘧啶+ATRA組，采用ATRA腹腔注射，觀察裸鼠一般狀況，取出腫瘤組織，HE染色，檢測各組胃癌細胞壞死情況；采用半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、實時定量PCR方法，分析檢測CD133mRNA、Sox2mRNA及GSK3BmRNA基因表達，并通過免疫組化法檢測CD133、Sox2及GSK3B蛋白表達。結(jié)果 與對照組相比較，氟尿嘧啶組、ATRA組、氟尿嘧啶+ATRA組腫瘤體積縮小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；氟尿嘧啶組、ATRA組、氟尿嘧啶+ATRA組高表達CD133、Sox2干細胞相關(guān)因子；ATRA組、氟尿嘧啶+ATRA組高表達GSK3B，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 ATRA作用后胃癌干細胞標(biāo)志物CD133、Sox2、GSK3B表達增加；CD133、Sox2、GSK3B表達增加可以抑制腫瘤細胞生長；ATRA老藥新用對胃癌的治療預(yù)后有一定的作用。

胃癌干細胞；CD133；GSK3B；全反式維甲酸

腫瘤干細胞是腫瘤細胞中的一小部分具有干細胞性質(zhì)的細胞群體，具有自我更新、無限增殖、不定向分化的潛能，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的根源[1]。有學(xué)者第一次證明了腫瘤干細胞的存在[2，3]。日本學(xué)者Takaishi和Wang[4]從胃癌細胞系和胃癌組織中分離出胃癌干細胞和干細胞樣亞群。目前研究發(fā)現(xiàn)，CD133、Sox2基因是腫瘤干細胞的表面標(biāo)志物，CD133與胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[5]，Sox2在多種腫瘤細胞中表達升高；GSK3B參與細胞分化、增殖、凋亡過程。全反式維A酸(all-trans retinoic acid,ATRA)是維生素A的衍生物，對多種細胞有調(diào)節(jié)生長和抑制增殖作用，維A酸受體(RAR、RXR)通過與其相應(yīng)的配體結(jié)合，參與細胞的增殖、分化、遷移和凋亡等多種過程的調(diào)控。前期的工作中，我們課題組已熟練掌握胃癌干細胞的分選方法，并初步觀察了胃癌干細胞生物學(xué)特性及ATRA對胃癌干細胞的影響[6-8]。筆者發(fā)現(xiàn)，ATRA對誘導(dǎo)胃癌干細胞分化和凋亡有一定影響。在本研究中，筆者進一步觀察了ATRA通過對CD133、Sox2、GSK3B基因表達的影響，達到抑制腫瘤干細胞生長的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及動物模型的建立 SPF級BALB/c裸鼠。胃癌細胞系SGC-7901，分選出CD133陽性的胃癌干細胞，取對數(shù)生長期的胃癌干細胞，裸鼠腋下皮下注射。將荷瘤鼠隨機分成4組：對照組、氟尿嘧啶組、ATRA組、氟尿嘧啶+ATRA組，分別給予腹腔注射生理鹽水、氟尿嘧啶、ATRA、氟尿嘧啶+ATRA；連用藥5 d，末次用藥2 h后處死裸鼠取出腫瘤，制備石蠟切片和PCR分析。

1.2 主要試劑 兔抗人單克隆抗體CD133、GSK3B、Sox2購于美國的Proteintech公司。 裸鼠RT-PCR一步法試劑盒及qRT-PCR一步法試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.3 HE染色法檢測各組荷瘤鼠給藥后移植瘤組織的細胞壞死情況 脫蠟水化：二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)各10 min脫蠟，100%乙醇(Ⅰ)、100%乙醇(Ⅱ)、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸餾水各5 min水化；蘇木精染色3 min；1%鹽酸分化液(瞬時)；氨水返藍(數(shù)秒)；伊紅染色2 min；梯度乙醇，二甲苯透明；中性樹膠封片，鏡檢。

1.4 免疫組化的方法檢測CD133、Sox2、GSK3B蛋白的表達 剝離移植瘤組織，10%甲醛固定24 h后制成蠟塊，切片厚度為5 μm。 脫蠟水化：二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)各10 min脫蠟，100%乙醇(Ⅰ)、100%乙醇(Ⅱ)、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸餾水各5 min水化；加3% H2O2室溫避光靜置10 min，用來阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；枸櫞酸鹽緩沖液500～600 ml，放入微波爐20 min，維持90 ℃；滴加山羊血清封閉液(PBS 1∶200稀釋)室溫20～30 min；滴加一抗CD133(1∶200)、SOX2(1∶100)、GSK3B(1∶50)，安放切片的濕盒放入4 ℃冰箱過夜；恢復(fù)至室溫后，滴加helper室溫靜置20 min；滴加二抗室溫靜置30 min；DAB顯色;蘇木精復(fù)染10 min；1%鹽酸、75%乙醇分化(瞬時)；1%氨水返藍10～15 s；蒸餾水、梯度乙醇、二甲苯各5 min透明；中性樹膠封片，鏡檢。

1.5 腫瘤組織CD133、Sox2、GSK3B mRNA的RT-PCR檢測 取腫瘤組織50 mg，利用Trizol法提取總RNA，按照RT-PCR一步法試劑盒檢測mRNA的表達。內(nèi)參基因為人β-actin，以目的基因與同一標(biāo)本的β-actin的RT-PCR產(chǎn)物條帶的光密度比值表示其相對mRNA的水平。引物序列及長度為：CD133(141 bp)，上游5′-AGCCTTCATCCACAGATGCT-3′，下游5′-GCGGCTGTACCACATAGAGAA-3′；Sox2(168 bp)，上游5′-GCGGCAACCAGAAAAACA-3′，下游5′-TCTCCGTCTCCGACAAAAGT-3′；GSK3B(127 bp)，上游5′-TATGGTCTGCTGGCTGTGTG-3′，下游5′-CTGATTTGCTCCCTTGTTGG-3′；β-actin(250 bp)，上游5′-AGGAGAAAACTGGCACCACACC-3′，下游5′-GATGGGCACAGTGTGGGTGACCC-3′。

1.6 腫瘤組織CD133、Sox2、GSK3BmRNA的實時熒光定量PCR檢測 腫瘤組織提取總RNA，用qRT-PCR一步法試劑盒合成mRNA，通過實時定量PCR擴增。每個樣本均設(shè)置3個復(fù)孔并且至少重復(fù)研究3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。組間比較采用單因素方差分析，非參數(shù)資料比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.2 裸鼠腫瘤組織CD133、Sox2、GSK3BmRNA的表達 氟尿嘧啶組、ATRA組、氟尿嘧啶+ATRA組高表達CD133、Sox2mRNA干細胞相關(guān)因子，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ATRA組及氟尿嘧啶+ATRA組GSK3BmRNA高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2，表2)。

圖1 荷瘤鼠腫瘤細胞GSK3B蛋白的表達(HE，×400)

表1 荷瘤鼠胃癌組織CD133、Sox2、GSK3B蛋白的表達 (±s；n=5)

注：與對照組比較，①P<0.05

表2 腫瘤組織CD133、Sox2、GSK3B mRNA的表達 (±s；n=5)

注:與對照組比較,①P<0.05

圖2 裸鼠腫瘤組織CD133、Sox2、GSK3BmRNA的表達

2.3 實時熒光定量PCR的結(jié)果 與對照組相比，氟尿嘧啶組、ATRA組、氟尿嘧啶+ATRA組高表達CD133、Sox2 mRNA干細胞相關(guān)因子，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ATRA組及氟尿嘧啶+ATRA組GSK3B mRNA高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖3 CD133、Sox2、GSK3B基因的相對表達量

3 討 論

中國是胃癌的高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率及死亡率居高不下。近年來，腫瘤干細胞的研究較多，Takaishi等[9]首次證實了胃癌干細胞的存在。腫瘤干細胞只占腫瘤細胞的極少部分，但由于其具有不斷自我更新能力、對放化療的抵抗和高轉(zhuǎn)移等特性，而成為腫瘤治療失敗、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源[10，11]。

本研究探討了氟尿嘧啶、ATRA作用后對胃癌干細胞相關(guān)表型CD133、Sox2及GSK3B表達的影響。結(jié)果顯示，ATRA刺激后胃癌細胞中CD133、Sox2的表達水平明顯高于對照組；胃癌細胞中GSK3B的表達較其他組有明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。胃癌干細胞相關(guān)表面標(biāo)志物CD133與胃癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系，短期藥物處理后，CD133等胃癌干細胞表達的增多；從另一個角度提示胃癌的治療可以從干細胞進行切入。

糖原合成酶-3( Glycogen synthase kinase-3 beta，GSK3B)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，普遍存在于哺乳動物真核細胞中，GSK-3B能作用于眾多信號蛋白結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細胞分化、增殖、存活和凋亡。GSK3B通過影響血液中的葡萄糖濃度，調(diào)控Bax/HKII的比例，進而影響線粒體滲透性及細胞色素C的釋放，參與細胞凋亡的調(diào)控。Lukas等[12]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的預(yù)后與GSK3B表達有著密切的關(guān)系，GSK3B高表達胃癌患者的預(yù)后優(yōu)于GSK3B低表達者。

本研究觀察了ATRA對GSK3B表達的影響，探討ATRA的應(yīng)用是否可以給胃癌的治療帶來新的觀念。通過PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，氟尿嘧啶組、ATRA組、氟尿嘧啶+ATRA組高表達CD133、Sox2mRNA干細胞相關(guān)因子，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。ATRA組及氟尿嘧啶+ATRA組GSK3BmRNA高表達，有統(tǒng)計學(xué)差異。研究觀察了，不同的藥物作用后胃癌干細胞相關(guān)標(biāo)志物的表達，以及GSK3B表達的變化，氟尿嘧啶作為臨床常用的化療藥物，可以使胃癌干細胞富集，表現(xiàn)為CD133、Sox2表達的增加；ATRA可抑制腫瘤細胞生長、誘導(dǎo)分化和凋亡。ATRA使用組表現(xiàn)為GSK3B的表達增加，GSK3B的高表達對胃癌的預(yù)后有一定作用。

綜上所述，本研究用ATRA及氟尿嘧啶作用于SGC-7901后，表達CD133、Sox2的細胞比例增加，我們通過細胞形態(tài)學(xué)、免疫組化發(fā)現(xiàn)CD133、Sox2高表達與腫瘤成瘤能力及腫瘤生長情況成負(fù)相關(guān)，提示ATRA在早期對胃癌細胞及干細胞可能均產(chǎn)生誘導(dǎo)分化作用。ATRA的應(yīng)用使得GSK3B的表達增加，提示ATRA可以使胃癌患者預(yù)后有一定作用。近年來，隨著對腫瘤干細胞研究的重視及傳統(tǒng)老藥在腫瘤中的新開發(fā)應(yīng)用，對我們認(rèn)識和把握腫瘤治療的策略和方法具有重要意義。

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(2016-10-20收稿 2016-11-15修回)

(責(zé)任編輯 梁秋野)

Effect of all-trans retinoic acid on the expression of GSK3B and gastric cancer stem cells related gene CD133, Sox2

LIU Dandan1，2，XIE Limin2，F(xiàn)ENG Yanjing2，LI Jinyi1，and WANG Xiangdang3.

1.Clinical Teaching and Research Section, 3. Purchasing Center，the General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Beijing 100039, China; 2. Graduate School of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, China

Objective To investigate the effect of all-trans retinoic acid (ATRA) on related genes CD133，Sox2 and GSK3B of gastric cancer stem cells in order to find a new starting point for the treatment of gastric cancer.Methods Human gastric cancer xenografts in nude mice were divided into control group, 5-FU group, ATRA group and 5-FU+ATRA group. After intraperitoneal injection of ATRA, the general condition of nude mice were observed before the tumor-bearing mice were sacrificed to remove the tumor tissue. HE staining was used to detect gastric cancer cell necrosis of the tissue. The expression of CD133mRNA, Sox2mRNA and GSK3BmRNA was detected using semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and real-time quantitative PCR analysis while immunohistochemistry was adopted to detect the expression of CD133, Sox2 protein and GSK3B.Results Compared with the control group, the tumor shrank in 5-Fu group, ATRA group, and 5-Fu+ATRA group. The difference was significant (P<0.05). The expressions of CD133, Sox2 stem cell-related factors were high in 5 -Fu group, ATRA group, and 5-Fu+ATRA group. However, there was significant difference in GSK3B expression between ATRA group and 5-Fu+ATRA group, (P<0.05).Conclusions After the administration of ATRA, gastric cancer stem cell markers, such as CD133 and Sox2, have a higher expression. The increased expression of CD133, Sox2 and GSK3B might inhibit the growth of tumor cells. The new use of ATRA can contribute to the prognosis of gastric cancer.

gastric cancer stem cell;CD133;GSK3B; All-trans Retinoic Acid

國家自然科學(xué)基金項目( 81072969，81273980)

劉丹丹，碩士，醫(yī)師。

100039 北京，武警總醫(yī)院：1.臨床教研室,3.采購中心；2.121000,錦州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

李錦毅， E-mail：Lijinyi.li@vip.sina.com

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