李巖異，戴碧璇，譚麗霞，張彩喬，李宏進(jìn)，張衛(wèi)婷

華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司，石家莊 050010

狂犬疫苗的研究進(jìn)展

李巖異，戴碧璇，譚麗霞，張彩喬，李宏進(jìn)，張衛(wèi)婷

華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司，石家莊 050010

全球每年由狂犬病毒引起的死亡人數(shù)為50 000例，狂犬病毒嚴(yán)重威脅著人類的健康。目前狂犬疫苗是抵御狂犬病毒的最有效的手段，隨著近些年生物技術(shù)的不斷發(fā)展，人類對新型疫苗的研制取得了顯著的成果，安全有效的人用狂犬疫苗的出現(xiàn)，為人類抵御狂犬病毒提供了更有效的保護(hù)。細(xì)胞培養(yǎng)的狂犬疫苗還將是當(dāng)前和未來一段時間人類抵御狂犬病毒主要手段，而單克隆狂犬病毒免疫球蛋白藥物不久的上市，將為人類抵御狂犬病毒提供更安全有效的治療。

狂犬病毒；狂犬疫苗；糖蛋白

1 狂犬病毒概述

狂犬病毒屬于彈狀病毒科、狂犬病毒屬。狂犬病毒基因組中有一個核糖核酸鏈，其反義鏈編碼5個蛋白分別是核蛋白、磷酸蛋白、基質(zhì)蛋白、糖蛋白和RNA聚合酶。每年感染狂犬病毒導(dǎo)致超過50 000人死亡，而且大部分發(fā)生在亞洲。除了狂犬病毒，狂犬病毒包含一系列公認(rèn)和判定的成員，這些病毒能夠造成人的偶然死亡[1]?？袢《臼且环N人畜共患的病毒，哺乳動物的食肉目和翼手目為主要宿主，家犬是作為人類疾病最重要的宿主來源。在美國，多種類的蝙蝠會引發(fā)狂犬病毒對人的傳播，尤其是在美國洛杉磯常見的吸血蝙蝠和在北美的昆蟲蝙蝠。這些情況的出現(xiàn)對公眾的健康造成威脅[2]。

2 狂犬病的傳播和治療

狂犬病毒轉(zhuǎn)移的發(fā)生起源于被感染的宿主的傷口，引起咬傷傷口處唾液病毒的沉積?？袢《臼且环N高神經(jīng)營養(yǎng)和高度可變的病毒，其發(fā)病期經(jīng)常會持續(xù)數(shù)月，病毒感染周邊神經(jīng)進(jìn)而上升到背根神經(jīng)節(jié)。一旦感染到脊髓，病毒迅速擴散至大腦，引發(fā)致命性的腦炎，最終殺死宿主。采用組織病理學(xué)的方法檢測感染的大腦后，結(jié)果顯示，許多病例中會出現(xiàn)獨特的包裹體和Negri小體。免疫標(biāo)記結(jié)果顯示，許多感染的神經(jīng)元伴隨著膠質(zhì)細(xì)胞的增生[3]。這些改變主要是在后腦中被發(fā)現(xiàn)，一旦感染發(fā)展，而沒有有效的治療，具有接近100%的致死率，在所有的感染中顯得非常獨特。但是，在被咬傷暴露傷口之前或在傷口暴露后很短時間內(nèi)給予疫苗的注射，當(dāng)前的疫苗能非常有效的防止這種結(jié)果的發(fā)生。病毒中和抗體的產(chǎn)生對于抵制感染非常重要，狂犬病毒疫苗促進(jìn)機體產(chǎn)生抗狂犬病毒抗體是有效的。但狂犬病發(fā)展到后期，狂犬病毒中和抗體是不起作用的，這可能是高致死率的一個重要的原因。雖然經(jīng)過廣泛的研究，但是對于該病毒沒有有效的抗病毒的治療方法[4-5]。

3 人用狂犬疫苗的發(fā)展

3.1 神經(jīng)組織來源的疫苗

在1885年7月6日，巴斯德最早發(fā)明了有效的疫苗來治療狂犬病毒，第一次采用疫苗來治療被咬傷的人類患者。治療方法是取被狂犬病毒侵染的兔子的脊髓漿液，經(jīng)無菌的空氣烘干后進(jìn)行接種。最初接種者被皮下注射完全滅活的漿液。巴斯德的方法被證明是有效的，隨后這種方法被廣泛傳播，但隨之產(chǎn)生了兩個問題。首先，如何保證滅活的一致性，因為在某些情況下，接種人由于接種疫苗發(fā)展為狂犬病。其次，如何從兔子身上產(chǎn)生疫苗以滿足對狂犬病的治療。從感染山羊和綿羊的腦部獲得狂犬病毒，并通過化學(xué)試劑苯酚進(jìn)行滅活，使得上述兩個問題得以解決。這些來源的疫苗雖然證明是有效的，但是與巴斯德疫苗一樣，含有高含量的髓鞘成分，這些成分能使一些疫苗接種者發(fā)生致敏反應(yīng)，在極端的案例中會發(fā)生致命的腦炎[6]。

也在考慮替代品，包括感染雞胚胎病毒的滅活，感染哺乳期老鼠腦部病毒的滅活，幼年期老鼠腦部的髓鞘含量比成年期老鼠腦部髓鞘要少。但是這些方法不能完全消除自身免疫性反應(yīng)的發(fā)生。因此，雖然一些國家還在應(yīng)用這些疫苗，但是世界衛(wèi)生組織不提倡使用來源于神經(jīng)組織的疫苗。

3.2 禽胚胎來源的疫苗

由于來源于神經(jīng)組織的疫苗具有上述不良反應(yīng)，1956年P(guān)eck[7]采用了鴨胚胎來制備疫苗，將狂犬病毒毒株接種至7日齡鴨胚卵黃囊，培養(yǎng)2周左右，將胚胎細(xì)胞磨碎，制成懸液后滅活。該疫苗在歐美國家被廣泛使用了近30年，但鴨胚胎來源的疫苗存在免疫原性差、中和抗體水平低于神經(jīng)來源的疫苗及不良反應(yīng)發(fā)生率高的缺點。自20世紀(jì)80年代，發(fā)達(dá)國家不再生產(chǎn)和使用這種疫苗，但人類利用禽胚胎進(jìn)行狂犬疫苗的研制沒有停止，瑞士一家公司采用化學(xué)提取和區(qū)帶離心技術(shù)，利用鴨胚胎成功生產(chǎn)了一種新型狂犬疫苗，該狂犬疫苗不良反應(yīng)少、免疫效果好，已經(jīng)上市多年。

3.3 細(xì)胞培養(yǎng)來源的疫苗

一種新的狂犬疫苗制備形式，即采用細(xì)胞培養(yǎng)的方法來培養(yǎng)狂犬病毒逐漸形成。第一個組織培養(yǎng)病毒來源的疫苗是將病毒在原發(fā)性地鼠腎細(xì)胞上培養(yǎng)，由該技術(shù)生產(chǎn)的疫苗于1968年獲加拿大批準(zhǔn)后使用。我國是在20世紀(jì)80年代用狂犬病病毒北京株生產(chǎn)疫苗；而日本等東南亞國家于20世紀(jì)80年代采用Flury HEP株適應(yīng)原代雞胚細(xì)胞，并廣泛使用；荷蘭采用原代狗腎細(xì)胞進(jìn)行病毒株的培養(yǎng)，該疫苗在免疫方面也取得了不錯的效果。

在滿足狂犬疫苗規(guī)模化生產(chǎn)需求方面，傳代細(xì)胞起著重要作用，傳代細(xì)胞會附著在生物反應(yīng)器中的微載體表面生長，同時可以通過胰蛋白酶進(jìn)行消化，進(jìn)行傳代和轉(zhuǎn)移，這種技術(shù)大大降低了生產(chǎn)成本。有代表性的傳代細(xì)胞為VERO細(xì)胞，該細(xì)胞是一種不限代次無限繁殖且不致癌的細(xì)胞，已被WHO批準(zhǔn)作為人類疫苗的生產(chǎn)基質(zhì)。由VERO細(xì)胞培養(yǎng)的狂犬病毒病毒收液毒價高、價格低、免疫效果非常好。

目前公認(rèn)最佳的狂犬疫苗是人二倍體細(xì)胞疫苗，該疫苗是由美國Wistar研究所首創(chuàng)，是用人肺細(xì)胞WI-38株適應(yīng)和培養(yǎng)病毒。法國某研究所用MRC-5細(xì)胞生產(chǎn)狂犬疫苗，并取得很好的效果。據(jù)統(tǒng)計，人二倍體細(xì)胞疫苗是接種后不良反應(yīng)最輕、免疫效果最好的疫苗[8]。

4 狂犬疫苗的發(fā)展趨勢

4.1 重組疫苗

隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，人類對基因工程的認(rèn)識不斷提高，出現(xiàn)了以活病毒為載體的疫苗和非復(fù)制病毒為載體的疫苗。

活病毒為載體的疫苗是將狂犬病病毒的G蛋白基因轉(zhuǎn)入到病毒內(nèi)而生產(chǎn)新型疫苗的方法。據(jù)報道，目前正在研究使用的活病毒有痘苗病毒、腺病毒等。由于該類方法生產(chǎn)的疫苗對臨床安全性的影響，目前該類疫苗都用于動物的免疫。該類疫苗因含有狂犬病毒的G蛋白，不具有狂犬病毒的感染能力，免疫原性好，在動物中免疫效果較好，不良反應(yīng)也少。1995年梅里埃公司將狂犬病毒糖蛋白重組痘苗病毒V-RG，生產(chǎn)疫苗Raboral，于1995年獲得了美國農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的許可證。由于該疫苗同時含有其他病毒毒性，且屬于基因工程病毒，不能應(yīng)用于人類。

非復(fù)制病毒為載體的疫苗采用的病毒載體不能在宿主中進(jìn)行復(fù)制傳代，能夠表達(dá)狂犬病毒的G蛋白，從而發(fā)生免疫應(yīng)答。由于該技術(shù)生產(chǎn)的疫苗對于宿主機體具有高度的安全性，所以可以進(jìn)行人用疫苗領(lǐng)域研究。目前主要的病毒載體為復(fù)制缺陷型痘病毒和復(fù)制缺陷型腺病毒。Cadoz等[9]采用金絲雀痘病毒為載體，將狂犬病毒株ERA的G基因插入其中，該重組病毒在哺乳動物細(xì)胞中是流產(chǎn)性復(fù)制，利用該研究成果生產(chǎn)的疫苗進(jìn)行了Ⅰ期臨床試驗，結(jié)果表明，志愿者都能很好地耐受該疫苗，接種后只是在注射部位出現(xiàn)輕微不適，接種后均可誘導(dǎo)志愿者產(chǎn)生抗體，具有人類疫苗的潛力。

4.2 植物來源疫苗

植物在進(jìn)行蛋白表達(dá)時，能夠進(jìn)行蛋白合成后的折疊、糖基化等后期修飾，同時植物的病原體對人類和動物不致病。所以，近些年來研究人員開始將狂犬病毒的G蛋白作為目的基因，重新插入重組植物病毒載體中感染植物，從而獲得狂犬病毒疫苗。正在研究的植物來源狂犬病毒疫苗所采用的植物有馬鈴薯、苜蓿花、煙草等[10-11]。該技術(shù)是采用植物來生產(chǎn)抗原的，這為疫苗的研究和發(fā)展提供了一個新的策略。該技術(shù)離實際應(yīng)用還有一定距離，但從現(xiàn)有的結(jié)果來看，這類疫苗的前景還是看好的。

4.3 DNA疫苗

DNA疫苗是將狂犬病毒的G蛋白的cDNA插入到質(zhì)粒DNA中，從而制得疫苗。1995年科學(xué)家就開始嘗試應(yīng)用該技術(shù)生產(chǎn)疫苗，通過對小鼠的免疫實驗發(fā)現(xiàn)，免疫后小鼠抗體增加，同時未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，用狂犬病毒攻擊接種后的小鼠，該疫苗表現(xiàn)出良好的保護(hù)作用[12]。DNA疫苗在接種者體內(nèi)能夠持續(xù)產(chǎn)生抗體，同時DNA疫苗的生產(chǎn)周期短，對溫度穩(wěn)定性強，便于儲運和大量制備，但誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生時間長，所以DNA疫苗適用于動物和高危易感人群的預(yù)防。DNA疫苗面臨的一個重要的問題就是安全性。DNA疫苗一旦接種后，就會長期存在于接種者體內(nèi)，雖然能長期使機體獲得免疫效果，但有可能會造成基因突變，引發(fā)機體癌變。所以，DNA疫苗未來在寵物中的應(yīng)用相對較好，在人類中應(yīng)用比較渺茫。

4.4 G蛋白亞單位疫苗、多肽疫苗與免疫復(fù)合物

4.4.1 亞單位疫苗

狂犬病毒中的G蛋白在免疫應(yīng)答中起著重要免疫作用。目前亞單位疫苗分為3類：糖蛋白亞單位疫苗、核糖核酸蛋白亞單位疫苗（RNP）、重組核酸蛋白亞單位疫苗。

糖蛋白亞單位疫苗分為天然糖蛋白疫苗與重組糖蛋白疫苗。天然糖蛋白疫苗來源于自然狀態(tài)下的狂犬病毒，通過采用TritonX-100處理，使糖蛋白從病毒膜表面分離下來，之后，糖蛋白直接免疫小鼠。小鼠的抗體表達(dá)量非常少，在配合佐劑制成疫苗后，接種者抗體表達(dá)會顯著提高。重組糖蛋白疫苗是采用病毒為載體表達(dá)狂犬病毒的糖蛋白，但該糖蛋白在后期提純方面存在困難，該疫苗未取得發(fā)展。

病毒復(fù)制時，核蛋白和狂犬病毒的RNA緊密結(jié)合，并將RNP包裹。RNP具有抗原性，但是無免疫反應(yīng)性，不能誘發(fā)機體產(chǎn)生中和抗體，但其可以長期產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。RNP還可以協(xié)同免疫反應(yīng)，用RNP初次免疫小鼠后，再使用狂犬病毒疫苗進(jìn)行免疫，誘生表達(dá)的中和抗體水平比未進(jìn)行RNP初次免疫的要高。

重組核酸蛋白亞單位疫苗也具有與RNP相同的免疫效果，蘇焱等[13]研究表明，RNP與重組核酸核蛋白的抗原性無差異。經(jīng)重組核酸核蛋白初次免疫小鼠后，誘生表達(dá)的中和抗體水平要明顯高于未經(jīng)重組核酸核蛋白進(jìn)行初次免疫的小鼠。

4.4.2 多肽疫苗

狂犬病毒多肽類疫苗分為化學(xué)裂解多肽、合成肽、基因工程肽、免疫復(fù)合物?；瘜W(xué)裂解后，狂犬病毒糖蛋白的抗原表面還能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，但由于片段發(fā)生斷裂，所出現(xiàn)的免疫效果低于自然狀態(tài)下完整的糖蛋白[14]。

根據(jù)狂犬病毒的核蛋白序列，Ertl化學(xué)合成了T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位結(jié)合位點的2條多肽，免疫小鼠后，能發(fā)揮與RNP相同的免疫效果，同樣不能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生。但根據(jù)狂犬病毒的糖蛋白序列合成的多肽，免疫小鼠后，能檢測到中和抗體，但其滴度明顯低于狂犬病毒誘導(dǎo)水平。

目前以植物為載體進(jìn)行狂犬病毒的多肽表達(dá)得到的多肽比化學(xué)合成的多肽抗原性要好、制備方便、價格低廉，是制備狂犬病毒多肽更好的方式[15]。

4.4.3 免疫復(fù)合物

亞單位疫苗、多肽疫苗毒性低，但由于其分子小，免疫原性差，而免疫復(fù)合物能克服這個缺點?？袢《镜拿庖邚?fù)合物是將高度純化的狂犬病毒糖蛋白分子嵌到脂質(zhì)體的雙層膜表面，模擬天然病毒的結(jié)構(gòu)，免疫小鼠后，可以誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生。Morein等[16]研制的狂犬病毒糖蛋白免疫復(fù)合物（ISCOM），免疫小鼠和狗后，誘導(dǎo)表達(dá)的中和抗體較高，免疫效果與商品化的人用狂犬病二倍體細(xì)胞疫苗相近。

5 狂犬疫苗替代品的發(fā)展

5.1 狂犬病毒抗體

盡管當(dāng)前的商品疫苗在抵抗狂犬病方面的成功是不容懷疑的，但是一直在嘗試開發(fā)新的替代品?？贵w在抵御狂犬病毒的傳播方面已被證實起到關(guān)鍵的作用?？贵w的重要目標(biāo)是病毒的糖蛋白，而糖蛋白是病毒顆粒唯一暴露于表面的蛋白，很多與單克隆抗體結(jié)合的抗原表位能夠被其識別。將狂犬病毒糖蛋白克隆至細(xì)菌質(zhì)粒中，然后在不同系統(tǒng)中表達(dá)該蛋白，已經(jīng)顯示能夠有效保護(hù)疫苗模式老鼠，抵御病毒。目前華北制藥開發(fā)研制的國家一類新藥重組人源抗狂犬病毒單克隆抗體（rhRIG），是我國第一個擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的重組人源抗狂犬病毒抗體，正在進(jìn)行Ⅱ期人體臨床試驗，結(jié)果良好。

5.2 反向遺傳學(xué)

在狂犬病毒治療領(lǐng)域中一直存在的挑戰(zhàn)是如何治療超過姑息治療的患者。實驗?zāi)Ｐ惋@示哺乳動物宿主腦部能夠產(chǎn)生對狂犬病毒固有的免疫反應(yīng)，但是有證據(jù)顯示，這種免疫反應(yīng)受到病毒磷蛋白的拮抗抑制。這種拮抗反應(yīng)可能導(dǎo)致一旦狂犬病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中繁殖，固有免疫和適應(yīng)性免疫的失效，最終導(dǎo)致宿主的死亡。因此現(xiàn)在鼓勵治療性的狂犬病毒的方式，通過修飾狂犬病毒的基因組得到更強的毒株接種到宿主中，以減輕狂犬病毒的感染[17-18]。

6 狂犬疫苗未來展望

近幾年，新型疫苗的研究取得了可喜的成果，從現(xiàn)有的研究進(jìn)展看，這些疫苗都有望成為動物疫苗有效的替代品。但要想用于預(yù)防人類狂犬病，這些新型的疫苗與傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)疫苗相比，還缺乏安全性和有效性證據(jù)?？袢≈委熜詥慰寺】贵w目前已獲得了顯著成果，有望在5年內(nèi)上市，為狂犬病毒暴露后的治療提供了重要的保護(hù)。另外，雖然對狂犬病毒感染后的治療藥物和疫苗越來越多，也已經(jīng)取得了顯著效果，但還是要從根本上控制人狂犬病的發(fā)病率。

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New progress and prospects of rabies vaccine

LI Yanyi，DAI Bixuan，TAN Lixia，ZHANG Caiqiao，LI Hongjin，ZHANG Weiting
North China Pharmaceutical Group Corporation Genetech Biotechnology Co., Ltd., Shijiazhuang 050010, China

Every year, the number of deaths caused by rabies virus is 50 000. Rabies virus is a serious threat to human health worldwide. The rabies vaccine is the most effective way against rabies virus in recent years. With the development of biotechnology, the new type of vaccines in humans has appear, which is safe and effective for human. Rabies vaccine prepared in cells would be the main method nowadays and in the near future, while monoclonal immunoglobulin drugs will soon provide a safer and more effective way against rabies virus.

rabies virus; rabies vaccine; glycoprotein

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.01.016

李巖異，碩士研究生。研究方向：醫(yī)藥工程。E-mail：heroyanyi@163.com