張永俠， 繆 淼， 原海燕， 楊永恒， 劉清泉， 黃蘇珍

(江蘇省中國科學(xué)院植物研究所/南京中山植物園，江蘇南京 210014)

23個(gè)德國鳶尾品種(系)的ISSR分析

張永俠， 繆 淼， 原海燕， 楊永恒， 劉清泉， 黃蘇珍

(江蘇省中國科學(xué)院植物研究所/南京中山植物園，江蘇南京 210014)

以23個(gè)德國鳶尾品種(系)為材料，利用ISSR標(biāo)記研究23份材料間的遺傳多樣性。結(jié)果表明，10條引物共獲得68條清晰可辨的條帶，多態(tài)性條帶為61條，平均每條引物擴(kuò)增出6.8條帶，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為89.7%；23個(gè)德國鳶尾品種(系)的平均有效等位基因數(shù)為1.897 1，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.331 3，平均Shannon信息指數(shù)為0.491 1，品種間的遺傳相似系數(shù)(GS)范圍在0.375～0.850，變幅為0.475，說明供試材料具有豐富的遺傳多樣性。UPGMA聚類分析結(jié)果表明，GS值0.706時(shí)，23個(gè)德國鳶尾品種(系)可聚為5類。利用2個(gè)ISSR引物UBC814、UBC900擴(kuò)增譜帶構(gòu)建的指紋圖譜可以把23個(gè)德國鳶尾品種(系)完全區(qū)分開。

德國鳶尾；遺傳多樣性；ISSR；指紋圖譜

德國鳶尾(IrisgermanicaL.)為鳶尾科鳶尾屬多年生草本植物，是世界著名的宿根花卉之一，耐寒性強(qiáng)，葉叢美觀，花朵碩大，色彩艷麗，具有較高的觀賞價(jià)值，世界各地廣為栽培[1]。德國鳶尾是栽培起源種，并非1個(gè)野生種，19世紀(jì)末20世紀(jì)初美國成為德國鳶尾的雜交育種中心，培育出許多有髯大花德國鳶尾品種[2]。ISSR是1994年Zietkiewicz等提出的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)[3]，具有操作簡單、穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富等特點(diǎn)。目前，ISSR分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析和品種鑒定[4-8]，鳶尾屬植物中也有相關(guān)報(bào)道。張敏等利用RAPD及ISSR標(biāo)記分析來自不同產(chǎn)地的鳶尾屬4個(gè)野生種的遺傳關(guān)系，結(jié)果表明，鳶尾屬種間遺傳多樣性較高，且種間變異大于種內(nèi)變異[9]。童俊等采用ISSR標(biāo)記研究34份鳶尾屬園藝品種的遺傳特性及親緣關(guān)系發(fā)現(xiàn)，多態(tài)性條帶比例達(dá)100%，供試材料具有豐富的遺傳多態(tài)性[10]。

目前，國內(nèi)栽培的德國鳶尾大多引自國外，自主培育的新品種還處于起步階段。由于對(duì)引進(jìn)品種的遺傳背景不了解，無法確定大部分栽培品種的親緣關(guān)系，且經(jīng)過長期的人工栽培選育，德國鳶尾存在較大的遺傳分化，采用傳統(tǒng)的分類方法很難區(qū)分其種下類群及品種。因此，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，從分子水平上對(duì)德國鳶尾種質(zhì)資源的親緣關(guān)系和遺傳多樣性開展研究，可為德國鳶尾種質(zhì)資源的挖掘、創(chuàng)新及德國鳶尾育種中的有效利用提供依據(jù)。本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)23個(gè)德國鳶尾品種(系)進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究，旨在為德國鳶尾品種鑒定和雜交親本選配提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的23個(gè)德國鳶尾品種(系)均采集于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所鳶尾種質(zhì)圃。12個(gè)品種于1997年引自西安植物園，引種編號(hào)分別為122、128、129、239、266、269、246、247、252、261、127、267，5個(gè)品種93E41076-8、93E41076-10、93E41078-17、93E41076-17、201425于1993年引自美國，另有6個(gè)為江蘇省中國科學(xué)院植物研究所培育的新品種(系)，分別為2013001、黃金甲、幻舞、風(fēng)燭、2010141、金舞娃(表1)。每個(gè)品種(系)采集1棵單株的嫩葉，置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱中保存，備用。

參考加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)的引物設(shè)計(jì)ISSR引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成；TaqDNA聚合酶、dNTPs、Marker、10×PCR buffer等購于寶生物工程(大連)有限公司；EDC-810型-PCR擴(kuò)增儀為東盛公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取與檢測 采用CTAB法[11]提取基因組DNA；核酸儀檢測DNA質(zhì)量和濃度，并稀釋至50 ng/μL。

1.2.2 引物篩選 擴(kuò)增反應(yīng)在EDC-810型-PCR儀上進(jìn)行，用2個(gè)DNA樣品分別對(duì)31條ISSR引物進(jìn)行篩選，選擇擴(kuò)增穩(wěn)定、清晰條帶的引物進(jìn)行正式擴(kuò)增。

1.2.3 反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序 通過對(duì)模板DNA濃度、Mg2+、dNTPs、Taq酶及退火溫度等試驗(yàn)，得到2種標(biāo)記的最適反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序。ISSR反應(yīng)體系25 μL：TaqDNA聚合酶1.0 U、模板DNA 50 ng、10×PCR buffer 2.5 μL、Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 0.15 mmol/L、引物0.4 μmol/L，用ddH2O補(bǔ)足到所需體積。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸120 s，38個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。ISSR的PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，電泳緩沖液為0.5×TBE，電泳時(shí)電壓為5 V/cm；電泳結(jié)束，在上海天能科技有限公司生產(chǎn)的凝膠成像系統(tǒng)儀上觀測分析并拍照。

表1 供試的23個(gè)德國鳶尾品種(系)情況

1.3 數(shù)據(jù)記錄與分析

記錄清晰可重復(fù)的DNA電泳條帶，對(duì)同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，遷移率相同的條帶記為1個(gè)位點(diǎn)，同一位點(diǎn)上有條帶記為“1”，無條帶記為“0”；運(yùn)用NTSYS-PC 2.10e版軟件計(jì)算供試材料的遺傳相似系數(shù)，進(jìn)行UPGMA聚類分析；采用POPGEN 1.32軟件計(jì)算Shannon信息多樣性指數(shù)(I)、Nei's基因多樣性指數(shù)(He)及觀察有效等位基因數(shù)(Ne)。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性

從31條ISSR引物中篩選出10條擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性高的引物，圖1為ISSR引物UBC880對(duì)23個(gè)德國鳶尾品種的ISSR-PCR擴(kuò)增電泳。由表2可見，10條ISSR引物共擴(kuò)增出68條清晰可辨條帶，其中多態(tài)性條帶為61條，平均多態(tài)性比率為89.7%，擴(kuò)增的DNA片段集中在150～2 000 bp之間，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出6.8條帶，其中6.1條具有多態(tài)性；多態(tài)性最高的為100%，低的只有75.0%。23個(gè)德國鳶尾品種(系)的GS值為0.375～0.850，變幅為0.475，不同引物的擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)的多態(tài)性水平有較大差異。

2.2 德國鳶尾品種(系)的遺傳多樣性分析

通過對(duì)23個(gè)德國鳶尾品種(系)群體遺傳參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果表明，23個(gè)德國鳶尾品種(系)平均有效等位基因數(shù)為1.897 1，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.331 3，平均 Shannon 信息指數(shù)為0.491 1，這表明23個(gè)德國鳶尾品種(系)間存在豐富的遺傳多樣性。

2.3 23個(gè)德國鳶尾品種(系)的聚類分析

以23個(gè)德國鳶尾品種(系)的68條譜帶數(shù)據(jù)建立遺傳相似系數(shù)矩陣，其中，品種269與239間的遺傳相似系數(shù)相對(duì)最大，為0.850；品種93E41076-17、93E41078-17與127間的遺傳相似系數(shù)相對(duì)最小，僅為0.375。根據(jù)遺傳相似系數(shù)矩陣，采用UPGMA法構(gòu)建供試23個(gè)德國鳶尾品種(系)的聚類圖。由圖2可見，于遺傳相似系數(shù)0.706處可將23個(gè)供試品種分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ類；Ⅰ類共包含16個(gè)品種(系)，包括4個(gè)矮型小花品種122、128、266、129，2個(gè)矮型大花品種93E41076-8、93E41076-10，10個(gè)中型大花品種(系)239、269、201425、金舞娃、幻舞、2013001、246、261、93E41076-17、93E41078-17，其中白色品種239和黃色品種269之間的遺傳相似系數(shù)達(dá)到0.850，表明這2個(gè)品種具有較高的同源性；自主選育的花大色艷的黃色品種金舞娃、深紫色品種幻舞、紫色品系2013001這3個(gè)品種(系)的植株形態(tài)極其相似，被聚在一起，三者間的兩兩遺傳相似系數(shù)平均為0.805，處于較高水平，表明這3個(gè)品種(系)也具有較高的同源性；Ⅱ、Ⅲ類均只包含1個(gè)品種，Ⅱ類為自主選育品種黃金甲，該品種外花瓣基部有紅褐色條紋，觀賞性較高，Ⅲ類為品種267，極矮品種，株高只有10～15 cm，外花瓣黃色，內(nèi)花瓣淡紫色，花色艷麗，觀賞性極高，且是培育矮生德國鳶尾的重要親本；Ⅳ類包含247、風(fēng)燭、2010141這3個(gè)品種(系)，其中風(fēng)燭為自主選育品種，花型奇特，為極其少見的黑紅色重瓣；Ⅴ類包含252、127這2個(gè)品種，均為高型淡紫色系品種，但兩者的遺傳相似系數(shù)不大。

表2 10條ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果

2.4 23個(gè)德國鳶尾品種(系)的ISSR指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)每個(gè)品種DNA擴(kuò)增圖譜中ISSR標(biāo)記位點(diǎn)條帶的有無或缺失，分別用0、1進(jìn)行數(shù)字化統(tǒng)計(jì)，形成由0、1排列的字符串，構(gòu)成1個(gè)數(shù)字指紋圖譜。由表3可見，由引物UBC814、UBC900構(gòu)建的數(shù)字指紋圖譜，可以快速鑒定出23個(gè)德國鳶尾品種(系)。

3 結(jié)論與討論

德國鳶尾的栽培品種遺傳背景復(fù)雜，現(xiàn)在栽培的德國鳶尾至少是有10個(gè)以上親本的園藝雜種[12]。因此，了解德國鳶尾種質(zhì)資源遺傳變異信息及親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，是培育優(yōu)良品種的基礎(chǔ)。本研究通過10條ISSR引物共在23個(gè)德國鳶尾品種(系)中擴(kuò)增出68個(gè)清晰可辨位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)有61個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)89.7%；23個(gè)德國鳶尾品種的Nei’s遺傳多樣性指數(shù)為0.331 3，遺傳相似系數(shù)為0.491 1，這說明德國鳶尾品種具有較為豐富的遺傳多樣性。

ISSR聚類分析表明，23種德國鳶尾品種(系)被劃分為5類，但并沒有按照花色或花型聚類，而是形態(tài)相似的品種被聚到1類，這表明基于ISSR標(biāo)記對(duì)德國鳶尾品種(系)進(jìn)行遺傳多樣性分析是可行的。自主選育的品種黃金甲和極矮生品種267分別被獨(dú)自聚為1類，說明這2個(gè)品種與其他品種遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)；唯一的畸形重瓣品種風(fēng)燭與247、2010141聚到1類，252和127形態(tài)特征相似，也被聚到1類。

花卉品種鑒定的方法主要依靠表型特征，雖然便捷，但是表型性狀受環(huán)境影響較大，鑒別錯(cuò)誤率較高，加之花卉品種資源逐年擴(kuò)大，品種的相似度也越來越高，導(dǎo)致通過傳統(tǒng)的表型鑒定方法來區(qū)分品種越來越難[13]。由于遺傳物質(zhì)DNA受環(huán)境影響較小，且多態(tài)性高，基于DNA擴(kuò)增的分子標(biāo)記成為花卉品種鑒定的有效方法，目前，已在麗穗鳳梨、朱頂紅、菊花、景東報(bào)春等花卉中構(gòu)建了分子指紋圖譜[5，13-15]。本研究利用引物UBC814、UBC900譜帶構(gòu)建的指紋圖譜可將23種德國鳶尾品種(系)全部區(qū)分開來，說明ISSR是一種構(gòu)建德國鳶尾種質(zhì)資源指紋圖譜的理想標(biāo)記。

表3 引物UBC814、UBC900構(gòu)建23個(gè)德國鳶尾品種(系)的特征數(shù)字指紋

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.012

2015-12-14

江蘇省科技支撐計(jì)劃(編號(hào)：BE2012349)。

張永俠(1987—)，女，安徽阜陽人，碩士，初級(jí)實(shí)驗(yàn)室助理，主要從事觀賞植物遺傳育種研究。Tel：(025)84347086；E-mail：zhangyongxia8712@163.com。

黃蘇珍，博士，研究員。E-mail：hsz1959@163.com。

S682.1+90.32

A

1002-1302(2017)02-0047-04

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