付浩++孫圣凱++陳孝儲(chǔ)++閆海洋+王志宏

[摘要] 目的 探討高血壓大鼠外周血液白細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)和端粒長度的變化，以及二者之間的相關(guān)性。 方法 SD大鼠40只，隨機(jī)分為3組：高血壓組（15只）、假手術(shù)組（15只）和空白對照組（10只）。高血壓組采用雙側(cè)腎動(dòng)脈后支結(jié)扎，術(shù)后予以8% NaCl飼料的方法構(gòu)建高血壓大鼠模型。選取術(shù)后4個(gè)月為觀察終點(diǎn)，利用鼠尾血壓計(jì)測量血壓，隨后行眶下靜脈叢取血，提取血液基因組DNA，Real-time PCR法測量相對線粒體DNA拷貝數(shù)和端粒長度。 結(jié)果 術(shù)后4個(gè)月時(shí)與假手術(shù)組比較，高血壓組大鼠血壓顯著升高[（178.36±10.21）比（128.47±8.74）mmHg，P < 0.01]，線粒體DNA拷貝數(shù)顯著增加[（1.49±0.43）比（1.09±0.51），P < 0.05]，端粒長度顯著縮短[（0.83±0.23）比（1.04±0.29），P < 0.05]。高血壓組大鼠線粒體DNA拷貝數(shù)與端粒長度變化呈負(fù)相關(guān)（r= -0.589，P < 0.05）。 結(jié)論 高血壓大鼠模型可出現(xiàn)外周血白細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)升高和端粒長度縮短，且二者呈負(fù)相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 高血壓；mtDNA拷貝數(shù)；端粒；大鼠

[中圖分類號(hào)] R544.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）11（a）-0033-04

高血壓是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素之一，在我國成人中，高血壓發(fā)病率可高達(dá)29.6%，已成為我國一個(gè)嚴(yán)重的公眾健康負(fù)擔(dān)[1]，其主要危害在于隨患病時(shí)間的延長，可引起動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、腦卒中等多種年齡相關(guān)疾病[2-3]。近期有研究顯示，線粒體功能障礙和端?？s短不僅是細(xì)胞老化過程中的兩個(gè)關(guān)鍵進(jìn)程，二者之間還可能存在著相互作用[4]，但是目前尚無研究涉及高血壓疾病中線粒體和端粒功能之間的可能聯(lián)系。因此，本研究旨在通過利用線粒體拷貝數(shù)和端粒長度的變化，來探索高血壓大鼠模型中線粒體和端粒功能之間的聯(lián)系，或可為高血壓繼發(fā)疾病的發(fā)病機(jī)制探索及早期治療提供更多的基礎(chǔ)研究支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

成年雄性SD大鼠40只，7～8周齡，體重220～250 g（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)0033432）。血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），UltraSYBR Mixture With ROXⅡ（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），Real-time PCR引物（安徽通用生物系統(tǒng)有限公司），Real-time PCR儀（Step One Plus，美國ABI公司），鼠尾血壓計(jì)（美國IITC公司），NanoDrop 2000（美國Thermo Fisher Scientific公司）。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過。

1.2 高血壓模型建立

將40只大鼠隨機(jī)分為高血壓組（15只）、假手術(shù)組（15只）和空白對照組（10只）。高血壓組大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后，按Eldawoody等[5]的方法，結(jié)扎雙側(cè)腎動(dòng)脈后支，術(shù)后1周給予含8% NaCl飼料，正常飲水。假手術(shù)組麻醉后僅暴露雙側(cè)腎動(dòng)脈15 min，術(shù)后正常飲食?？瞻讓φ战M不進(jìn)行任何操作。

1.3 高血壓模型評估

采用標(biāo)準(zhǔn)尾部測壓法，術(shù)后1個(gè)月時(shí)進(jìn)行血壓測量以判斷高血壓組是否出現(xiàn)血壓升高，術(shù)后4個(gè)月取材前再次測量血壓予以確認(rèn)，兩次測量均表現(xiàn)為血壓升高則說明該高血壓模型穩(wěn)定可靠。

1.4 血液標(biāo)本采集

于模型建成后，利用直徑0.9 mm毛細(xì)玻璃管進(jìn)行眶下靜脈叢取血1.5 mL。

1.5 端粒長度及mtDNA拷貝數(shù)測定

按照說明書提取血液基因組DNA。參考文獻(xiàn)[6-7]設(shè)計(jì)端粒（Tel）、線粒體單拷貝基因COXⅠ和內(nèi)參基因36B4的引物，引物序列及終濃度見表1。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2×UltraSYBR Mixture 12.5 μL，基因組DNA25 ng，以及相應(yīng)體積的引物和滅菌雙蒸水，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。目的基因與內(nèi)參基因的PCR反應(yīng)條件一致，采用兩步法：95℃ 10 min預(yù)變性后，進(jìn)行95℃ 15 s、60℃ 1 min共40個(gè)循環(huán)，95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 15 s、60℃ 15 s行融解曲線分析。應(yīng)用相對定量法計(jì)算端粒長度和線粒體的相對拷貝數(shù)，即得出各樣本不同基因的CT值后，首先計(jì)算出目的基因與單拷貝基因CT值的比值（T/S）：[2Ct（tel）/2Ct（36B4）]-1=2-ΔCt，再用各樣本的T/S值除以對照組T/S的平均值，得到相對T/S值：2-ΔCt/2-ΔCt（對照平均值）=2-ΔΔCt。當(dāng)相對T/S=1時(shí)，代表實(shí)驗(yàn)組的目的基因表達(dá)與對照組完全相同，當(dāng)相對T/S>1時(shí)，說明實(shí)驗(yàn)組目的基因表達(dá)更多，反之說明目的基因表達(dá)更少。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān) 性檢驗(yàn)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠存活情況

高血壓組1只大鼠因術(shù)后局部感染導(dǎo)致粘連性腸梗阻，于術(shù)后10 d死亡，其余均存活至觀察終點(diǎn)。

2.2 各組大鼠血壓比較

術(shù)前三組血壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.340，P=0.275）。術(shù)后1個(gè)月和術(shù)后4個(gè)月時(shí)，高血壓組血壓均顯著升高（均P < 0.01），假手術(shù)組與空白對照組比較，血壓差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P > 0.05）。

2.3 兩組端粒長度及mtDNA拷貝數(shù)比較

術(shù)后4個(gè)月時(shí)，高血壓組與假手術(shù)組比較，mtDNA拷貝數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（1.49±0.43）比（1.09±0.51），P < 0.05]，端粒長度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（0.83±0.23）比（1.04±0.29），P < 0.05]。

3 討論

線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是線粒體內(nèi)相對獨(dú)立的環(huán)狀基因組DNA，其在基因組中的個(gè)數(shù)稱為mtDNA拷貝數(shù)。線粒體DNA由于缺少組蛋白的保護(hù)，極易受到炎癥、氧化應(yīng)激、激素水平變化等因素的損傷，造成線粒體基因突變，從而出現(xiàn)功能障礙，但線粒體內(nèi)DNA的修復(fù)系統(tǒng)效率很低，機(jī)體維持線粒體基因及功能完整性的主要機(jī)制是誘導(dǎo)mtDNA拷貝數(shù)的增加[8]。此前已有眾多研究顯示，白細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)不僅可以反映線粒體的功能與生物合成，還可以作為一種替代性標(biāo)志物，提示與線粒體功能障礙相關(guān)的多種代謝性疾病，例如胰島素抵抗和糖調(diào)節(jié)異常[9]、非酒精性脂肪肝病[10]和高同型半胱氨酸血癥[11]，但其在高血壓等血管疾病中的變化尚存在爭議。Chen等[12]發(fā)現(xiàn)，在高血壓大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)mtDNA拷貝數(shù)顯著升高，可能是因?yàn)檠趸瘧?yīng)激可通過氧化線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）上的二硫鍵部位和吡啶核苷酸部位，使MPTP持續(xù)開放，并降低線粒體膜電位，從而激活線粒體凋亡通路[13]，使線粒體拷貝數(shù)發(fā)生了代償性增加。但也有學(xué)者得出了相反的結(jié)論，Kim等[4]發(fā)現(xiàn)，在老年女性中，高血壓組患者表現(xiàn)出減少的外周血白細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)，可能是由于該研究中受訪者患病時(shí)間較短，mtDNA拷貝數(shù)尚未發(fā)生明顯的代償性增加。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高血壓4個(gè)月后，線粒體拷貝數(shù)顯著升高，提示高血壓造成了線粒體功能障礙并使拷貝數(shù)發(fā)生了代償性增高。這表明線粒體功能的損傷與高血壓的發(fā)展密切相關(guān)，可能是由于長期高血壓造成的慢性氧化應(yīng)激刺激觸發(fā)了呼吸核因子與線粒體轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)線粒體增殖從而降低損傷mtDNA所占比例，以代償呼吸功能的下降，故mtDNA拷貝數(shù)發(fā)生了代償性升高[14]。

端粒是真核細(xì)胞染色體末端的一段非編碼重復(fù)序列，細(xì)胞每次分裂端粒都會(huì)縮短30～150堿基，當(dāng)縮短到一定程度時(shí)，細(xì)胞則會(huì)進(jìn)入衰老階段并發(fā)生凋亡[15]。端?？s短程度代表了衰老的水平，且與多種心血管疾病的發(fā)生有關(guān)，但其在高血壓疾病中的變化目前尚有爭議。Bhupatiraju等[16]研究發(fā)現(xiàn)，印度人群中高血壓患者端粒長度與健康人群相比明顯縮短，且端粒長度與年齡、舒張壓、收縮壓均呈負(fù)相關(guān)。Farrag等[17]也發(fā)現(xiàn)，高血壓患者外周血液白細(xì)胞端粒長度與健康人群相比顯著縮短，而且與BMI指數(shù)無關(guān)。這可能是由于高血壓時(shí)血管表面切應(yīng)力改變，可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)，引起一氧化氮合成受損，加重氧化應(yīng)激反應(yīng)[18]，造成了端粒DNA單鏈斷裂，從而在DNA復(fù)制時(shí)引發(fā)錯(cuò)配與重排，使端?？s短[19]。然而Morgan等[20]提出，高血壓的發(fā)生發(fā)展與端粒長度的縮短無關(guān)，這可能由于高血壓作為一種慢性疾病，其對機(jī)體的影響是漫長而緩慢的，該研究進(jìn)行時(shí)納入標(biāo)準(zhǔn)中沒有包括患病年限，且研究樣本例數(shù)（55例患者）較少，導(dǎo)致了高血壓與端粒縮短的相關(guān)性尚未顯現(xiàn)出來。本實(shí)驗(yàn)中，高血壓模型大鼠端粒顯著縮短，表明端?？s短與高血壓密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，mtDNA拷貝數(shù)與端粒長度呈負(fù)相關(guān)，表明線粒體和端粒不僅與高血壓的發(fā)展相關(guān)，兩者之間還會(huì)發(fā)生相互影響。這與Tyrka等[21]在研究童年經(jīng)歷過逆境或曾患有精神疾病的人群時(shí)發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相一致?？赡茉蛉缦拢壕€粒體的環(huán)狀DNA共編碼37個(gè)基因，包括呼吸復(fù)合物亞基和一些線粒體tRNA和rRNA[4]，調(diào)節(jié)線粒體生物基因組和包括細(xì)胞呼吸在內(nèi)的多種功能時(shí)，核基因編碼的核蛋白表達(dá)發(fā)揮著重要作用。這些核蛋白包括核轉(zhuǎn)錄共激活劑（PGC-1α和PGC-1β）、AMP活化蛋白激酶、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)（mTOR）等[22]。當(dāng)對核基因起保護(hù)作用的端粒受到氧自由基、炎癥因子等攻擊時(shí)，一方面受損的端?？烧T導(dǎo)p53表達(dá)，抑制轉(zhuǎn)錄共激活劑PGC的功能，從而造成線粒體功能障礙；另一方面端粒損傷還可直接影響線粒體氧化呼吸鏈相關(guān)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，導(dǎo)致線粒體功能障礙[23]。該結(jié)果不僅進(jìn)一步解釋了線粒體和端粒與高血壓的密切關(guān)系，還提示了若以端?；蚓€粒體為靶點(diǎn)對高血壓進(jìn)行干預(yù)時(shí)，應(yīng)同時(shí)兼顧二者，或許能發(fā)揮更好的效果。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過手術(shù)構(gòu)建的高血壓大鼠模型發(fā)現(xiàn)，高血壓大鼠mtDNA拷貝數(shù)顯著升高，端粒顯著縮短，并認(rèn)為mtDNA拷貝數(shù)增加所代表的線粒體功能障礙與端粒縮短密切相關(guān)。這為進(jìn)一步解釋高血壓疾病引起年齡相關(guān)心腦血管病的發(fā)生機(jī)制提供了幫助，并為預(yù)防高血壓引起繼發(fā)臟器損害提供了潛在治療靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2016-08-02 本文編輯：程 銘）