豆興堂

（遼寧省畜牧科學研究院， 遼寧 遼陽 111000）

羊體外受精技術研究概況

豆興堂

（遼寧省畜牧科學研究院， 遼寧 遼陽 111000）

本文較系統地總結了羊體外受精技術研究狀況，包括卵母細胞體外成熟、體外受精等技術環(huán)節(jié)，并提出了需要解決的技術問題。

羊；卵母細胞；精子；體外受精；胚胎

近年來，我國山羊飼養(yǎng)業(yè)發(fā)展迅速，但也存在一些問題，主要表現在山羊良種化程度不高、世代間隔較長、遺傳改良速度較慢。優(yōu)良種公、母羊數量少難以滿足大量低產山羊的改良需求，而一些生物技術如母羔超排、體外受精、胚胎移植等技術可以最大限度地發(fā)揮具有優(yōu)秀生產性能的種公、母羊遺傳資源，滿足我國養(yǎng)羊業(yè)對良種的巨大需求。因此研究解決羊體外受精等重要相關技術瓶頸就成為迫切任務之一。

哺乳動物體外受精研究已經有幾十年的歷史，已相繼在130余種哺乳動物上獲得成功[1]。1985年Hanada等[2]在世界上首次實現山羊體外受精。1990年我國錢菊汾等[3]成功獲得一只“試管山羊”。1996年劉東軍等[4]經體外受精胚胎移植得到了“試管山羊”。2004年王公金[5]等經過胚胎移植成功產下了“試管山羊”。成國祥等[6]用超排山羊卵巢排卵后第1天的98枚卵巢卵母細胞，體外成熟體外受精卵裂率為21.43%，21枚2細胞胚移植5頭受體，獲2只羔羊。大量研究證明，經體外受精技術生產的胚胎，通過胚胎移植給代孕受體羊完全可以正常生產羔羊。

1 卵母細胞獲取與體外成熟

1.1 卵母細胞的獲取方法

主要有離體采集和活體采集。離體采集利用卵母細胞數有限，不可重復使用，且其種質一般都相對較差。活體采集能獲得大量種質優(yōu)良山羊的卵母細胞用于體外受精生產胚胎，可反復進行且對供體山羊的生產性能和生殖機能無不良影響。因此，活體采卵技術成為體外受精一項關鍵技術。

活體采卵有手術法、B型超聲波法和腹腔鏡法。手術法采集卵母細胞操作簡便，容易觀察卵巢情況，回收率較高。許杰等[7]研究表明，抽吸法得到的平均卵母細胞數最多，刺破法較為適合回收山羊的卵巢卵母細胞。

腹腔鏡法隨著體外胚胎生產技術的發(fā)展，近些年逐漸得到應用。Berlinguera等[8]報道了LOPU采集卵母細胞的操作方法，可以參照操作。Graft等[9]認為，腹腔鏡活體采卵技術容易觀察卵泡，在抽卵時可以對卵巢頻繁地進行沖洗，可能會減少粘連的發(fā)生。

B型超聲波法。1987年Callesen等[10]首先報道了B超應用于卵母細胞采集。Graft等[9]報道了此技術在羊上的具體操作方法，但可見卵泡數較少，最終獲卵數也較少。

1.2 卵母細胞體外成熟培養(yǎng)

1.2.1 卵母細胞成熟

卵母細胞的成熟被稱為卵母細胞獲能。該過程包括恢復減數分裂并進入到第2次減數分裂中期（MⅡ）的核成熟和經歷一系列復雜生理生化變化的細胞質成熟[3]。卵母細胞成熟過程中細胞核發(fā)生生發(fā)泡破裂（germinal vesicle breakdow，GVBD）、染色質濃縮和排出第1極體等一系列形態(tài)學的變化，當減數分裂完成時，標志著卵母細胞核的成熟。人工采集的卵母細胞大都完成了生長，進入成熟期，其經歷了第2次減數分裂間期而達到中期（MⅡ）[2]。卵母細胞體外成熟是以卵丘細胞擴張、第1極體排出作為形態(tài)上的標志。卵母細胞減數分裂的恢復是以 GVBD 為判斷標準的，第1極體的排放是卵母細胞成熟的標志[11]。

1.2.2 卵母細胞成熟培養(yǎng)主要因素

1.2.2.1 基礎培養(yǎng)液

卵母細胞體外成熟基礎液有TCM199、Ham’s F-12、Menezo’s B2、NUSC23和MEM等，以TCM199應用最為廣泛。劉靈等[12]研究表明，TCM199和Ham’s F-12都是山羊卵母細胞體外成熟合適的培養(yǎng)基。林峰等[13]以TCM199為基礎培養(yǎng)液，添加10 IU/mL PMSG、10 IU/mL hCG和FCS等體外成熟培養(yǎng)卵母細胞，結果15% FCS組卵母細胞成熟率為67 %。

1.2.2.2 培養(yǎng)環(huán)境條件系統

溫度對卵母細胞體外成熟培養(yǎng)有很大影響。研究表明，一般家畜的卵母細胞成熟培養(yǎng)溫度均采用38～39℃，5% CO2空氣、飽和濕度[14]。氣相環(huán)境中的CO2濃度由于目前培養(yǎng)液中NaHCO3濃度多為25～30 mmol/L，故一般都采用5%的CO2。另有氣相環(huán)境為：5%CO2、5%O2、90%N2。但Azambujaa等[15]研究結果表明，5%CO2、5%O2、90%N2下成熟培養(yǎng)的卵母細胞，桑椹胚和囊胚發(fā)育率明顯低于含5%CO2的空氣。一般采用微滴培養(yǎng)和四孔板培養(yǎng)。

1.2.2.3 激素

卵母細胞成熟培養(yǎng)中常用的激素有FSH、LH、E2等。王海濱等[16]研究認為，體外培養(yǎng)卵母細胞時必須添加FSH，FSH維持顆粒細胞和卵母細胞間的聯系，有利于卵母細胞發(fā)育成熟。Kobayashi等[17]研究結果表明，LH或hCG可以誘導卵母細胞成熟分裂能力的恢復。Zuelke等[18]證實，在無血清時LH用于體外培養(yǎng)卵母細胞成熟，能提高卵母細胞成熟后的胚胎發(fā)育能力。雌二醇（E2）可促進卵母細胞在體外成熟過程中受精和胚胎發(fā)育。劉靈等[12]研究表明，卵母細胞成熟培養(yǎng)液中添加1 μg/mL E2，成熟率（79.4 %）顯著高于對照組（55.6 %），說明成熟液添加E2對其成熟是有益的。因此E2目前被廣泛用于卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)。

1.2.2.4 血清

卵母細胞體外成熟液通常都添加血清。常用的血清有FCS、OCS和SS，眾多研究結果表明，以FCS效果最好。Sanbusissho和Threlfall[19]比較了不同發(fā)情階段母牛血清，結果表明，發(fā)情盛期的母牛血清要優(yōu)于其他發(fā)情周期階段的血清。張涌等[20]研究結果表明，卵母細胞體外成熟同種動物的血清要優(yōu)于異種動物血清。血清成分較為復雜，效果不夠穩(wěn)定，因此近年開展許多血清替代物研究，可能是卵母細胞體外成熟培養(yǎng)一種方向。

1.2.2.5 生長因子

EGF是一種單鏈的多肽，對顆粒細胞等多種細胞具有促進分裂的作用。王艾平等[21]研究結果表明，EGF對山羊COCs體外成熟和卵裂發(fā)育具有明顯的促進作用，成熟液中EGF優(yōu)選濃度為50 μg/mL，COCs成熟率(75.45 %～75.18 %)和卵裂率(72.4%～74.1%)均顯著高于其它組。劉丑生等[22]研究EGF對綿羊卵母細胞成熟及卵裂的影響表明，50 μg/mL的EGF的成熟率和卵裂率分別為71.2%和45.5%，顯著高于對照組與其他組；當EGF濃度達到100 μg/mL時成熟率和卵裂率最高，分別為72.9 %和45.7 %。羊卵母細胞成熟液中的常用量為10～50 ng/mL。

1.2.2.6 其他

卵母細胞體外成熟培養(yǎng)時間，山羊一般為24～26 h，不同動物其培養(yǎng)時間不同。劉靈等[12]研究表明，山羊卵母細胞成熟24 h、25 h和26 h，成熟率為（78.3 %、80.0 %和80.6 %）沒有差異。李穎等[23]研究了結果表明，山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)20 h、22 h、24 h,成熟率顯著高于培養(yǎng)18 h、26 h、,30 h（P<0.05）。王超[24]研究顯示，山羊卵母細胞37℃ 下的成熟率顯著低于38.5℃、39.0℃下的成熟率，培養(yǎng)24 h和培養(yǎng)26 h的成熟率極顯著高于培養(yǎng)18 h和20 h。卵母細胞的成熟潛力還與采卵季節(jié)相關，繁殖季節(jié)獲取的卵母細胞成熟率較高。

2 精子獲能與體外受精

2.1 精子獲能

精子體外獲能處理是體外受精技術的重要環(huán)節(jié)。Austin發(fā)現并定義了哺乳動物精子獲能（Capacitation）現象。現已弄清精子在體內的獲能過程如下：哺乳動物生殖道內的獲能因子中和精子表面的去能因子，并促使精子質膜的膽固醇外流，導致膜的通透性增加。而后Ca2+進入精子內部，激活腺苷酸環(huán)化酶，抑制磷酸二酯酶，誘發(fā)cAMP的濃度升高，進而導致膜蛋白重新分布，膜的穩(wěn)定性進一步下降，精子的獲能即完成[3]。因此，可以通過脫除精子被膜蛋白，增加通透性和Ca2+內流的處理方法誘發(fā)精子獲能。

2.2 精子獲能處理方法

精子體外獲能方法可分為兩步，首先是精子洗滌，篩選活精子；其次進行精子獲能處理。

精子經一次或多次離心后除去雜質、死精子、凍精保護液及稀釋液等，從而篩選活力好的精子。懸浮法是篩選高活力精子最為有效的一種方法。Parrish等[25]首次采用懸浮法分離牛的精子進行體外受精，結果表明，可使受精率由46%提高到59%。Purvis和Egdetveit[26]研究表明，如將懸浮的試管傾斜30°，則能提高精子的可利用數量50 %～100 %。山羊多用mDM液和不含BSA的BO液。

其次進行精子的獲能處理。主要使用鈣離子載體、肝素和BSA等，以促使Ca2+進入精子頂體，并刺激精子內部pH升高，從而誘發(fā)精子獲能。

鈣離子載體A23187獲能處理。馬恒東等[27]研究表明，鈣離子載體的添加量在0.3 μmol/L時，利用去透明帶金黃地鼠卵穿卵試驗，穿透率達到68.2%；咖啡因與肝素、鈣離子載體具有明顯的協同作用。將獲能的精子與山羊卵母細胞進行體外受精孵育17 h，也獲得了60%以上的受精率。葉華虎等[28]比較不同獲能誘導劑對山羊精子體外獲能及受精能力的影響，結果表明，0.1 μmol/L， 0.4 μmol/L，0.7 μmol/L IA均能提高精子獲能率，其中0.4 μmol/L處理組精子獲能率最高為56.2%；IA組的卵裂率明顯高于肝素組(P<0.05)，IA表現出更強的促卵裂發(fā)生效果。

肝素獲能處理。大多數研究者體外受精中肝素的濃度為10～50 μg/mL。錢紅娟等[29]認為，用肝素誘導山羊精子體外獲能10 Lg/mL的濃度最有利。呂麗華等[30]山羊卵母細胞體外受精的研究表明，肝素（50 μg/mL）組和鈣離子載體（0.1 μmol/mL）組受精率分別為56.0%和67.0%，顯著高于咖啡因（10 mmol/L）組的21.0%；肝素組卵裂率（51.1%）顯著高于鈣離子載體組（36.3%）和咖啡因組（19.0%）；囊胚率肝素組（17.8%）與鈣離子載體組（11.7%）差異不顯著，表明肝素處理精子獲能受精比較穩(wěn)定。

精子獲能檢測。近年來，Moller[31]和Aarons[32,33]等報道采用考馬斯亮藍（CBB）染色法來檢測小鼠精子頂體反應。CBB G250是常用的蛋白染料，它對頂體膜或頂體內含物具有特異親和性。AR發(fā)生后，頂體內的蛋白酶流失，CBB G250結合量明顯減低，因而頂體著色較淡。反之，未發(fā)生AR的精子，頂體著色較深。江一平等[34]通過用3.5%高氯酸水溶液配制0.05%考馬斯亮藍(R250)染色液浸染人精子30 min，頂體完整者頂體區(qū)染成紫藍色，頂體反應者則不染。建立了一種檢測人精子頂體反應的簡便實用新技術，方法學檢驗證明新技術結果可靠。卓丹心等[35]在先前報道[32]基礎上，將CBB液加以改良建立了一種哺乳動物精子AR檢測較通用簡便的技術。研究結果表明，經CBB染色后，頭部呈現出兩種類型染色特征———A型和B型。A型未獲能精子頂體區(qū)成紫藍色，頂體后區(qū)淺紫色；B型獲能精子頂體區(qū)不染色或染淺紫色，頂體后區(qū)與A型相似。經方法學實驗表明，CBB染色批內變異系數低，說明可重復性好，結果可靠，可用于AR的檢測實驗。葉華虎等[36]的研究證實，考馬斯亮藍（CBB）染色技術可用于哺乳動物精子頂體狀態(tài)的準確評價。陸海一等[37]也驗證了CBB染色技術可作為檢測人精子形態(tài)和頂體反應的可靠而實用的方法。與傳統的瑞-吉染色法相比，CBB-G250染色法不僅操作簡單、試劑配制方便，而且染色時間較短、不受染液pH的影響。

2.3 精子與卵母細胞體外受精方法

2.3.1 體外受精系統

卵母細胞體外受精培養(yǎng)系統主要有微滴法和四孔培養(yǎng)板法。微滴法是一種應用最廣的培養(yǎng)系統。該法的優(yōu)點是受精液及精液的用量均較少，體外受精的效果亦較好。四孔板培養(yǎng)法是采用四孔板為體外受精器皿，每孔加入500 μL受精液和100～150枚體外成熟的卵母細胞，然后加入獲能處理的精子，在培養(yǎng)箱中孵育20～24 h。該法的優(yōu)點是操作相對比較簡單，受精結果不受石蠟油質量的影響。精卵體外受精一般在38.5℃、5%CO2的空氣、飽和濕度下進行。

2.3.2 受精體系

用于體外受精的基礎液通常為SOF液、TALP液和BO液，主要成分為無機鹽離子，不含復雜的氨基酸和維生素等成分。張鎖鏈等[38]用BO液將精液稀釋、離心洗滌后，用含有20 mg/ mL BSA(Sigma)和5 mg/mL肝素調整精子密度為（20～30）×106個/mL，用精子懸浮液做成微小滴，將成熟培養(yǎng)后的卵母細胞移入該微小滴中進行受精處理6 h后，將卵子移入以TCM199為基礎液的發(fā)育用培養(yǎng)液中繼續(xù)進行培養(yǎng)，卵裂率為40%～49.6%，囊胚率為15.8%～18.8%。劉新峰等[39]對不同受精液對山羊卵母細胞體外受精的影響進行了研究。結果表明，BO液的受精率（62.2%）顯著高于TCM199液（44.7%），且卵裂率（21.6%）顯著高于TALP液（9.1%），極顯著高于TCM199（0.0%）。武建朝[40]對比了BO液和TALP液受精結果，表明TALP受精液受精率和卵裂率顯著高于BO液（55.88% : 33.33%，42.11% : 30.00%），但桑堪胚、囊胚率差異不顯著。說明TALP液比BO液更適合性成熟前山羊卵母細胞的體外受精。近年來，出現了將SOF液用于體外受精的受精液。陳曉勇[41]以SOF液為基礎液，比較了羔山羊卵母細胞與成年山羊卵母細胞體外受精與胚胎發(fā)育能力，結果顯示，羔羊卵母細胞在卵裂率（59.0%）和桑椹胚率（17.4%）方面都極顯著性低于成年羊卵裂率（82.4%）和桑椹胚率（46.4%）。

2.3.3 精卵作用時間

精卵作用時間對體外受精的效果非常重要，過短不足以保證受精率，過長又容易引起多精入卵。同時精卵孵育時間也受受精液中輔助獲能物質的影響。精卵孵育作用時間也依受精液而不同，BO受精液[42]精卵作用6～8 h，TALP受精液精卵作用18～20 h，SOF受精液精卵作用22～24 h。

2.3.4 其他

體外受精效果還受精卵比率、溫度、水質等因素的影響。精子濃度若過高易引起多精入卵，若過低又影響受精率，通常適宜體外受精的精子濃度為（1.0～1.5）×106個/mL，精卵比率為10 000～20 000∶1。溫度對體外受精效果有很大影響。戴榮亮[11]研究結果顯示，在37℃、38℃和39℃下，卵母細胞成熟率及其受精率差異不顯著，但39℃下的受精率（14.7%）高于 38℃（13.4%）和 40℃（12.8%）受精率。水質是體外受精的一個重要影響因素，對體外受精的成功與否至關重要。水質量對IVF有明顯影響，配制受精液的水應該為超純水，是通過離子交換柱去除水中雜質和離子，水在配制前應經過高溫高壓滅菌。陳曉勇等[43]研究表明，小尾寒羊胚胎發(fā)育液中添加10 μmol/L EDTA，16細胞以上胚胎率（100%）極顯著高于對照組（46.97%）。

3 早期胚胎體外發(fā)育培養(yǎng)

體外受精的早期胚胎發(fā)育存在阻斷現象，并不是都能發(fā)育至囊胚階段。近些年，通過改善體外培養(yǎng)條件，胚胎體外發(fā)育的能力有所提高。體外受精胚胎體外培養(yǎng)液主要有：復雜的培養(yǎng)液（TCM199等）和成分明確的培養(yǎng)液（SOF、CR1等）?；境煞种饕o機鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物、抗生素、能量底物和蛋白質等。呂麗華[44]研究山羊胚胎體外培養(yǎng)結果表明，顆粒細胞和輸卵管上皮細胞共培養(yǎng)胚胎條件下，體外受精胚胎的卵裂率分別為 46.3%和40.8%，顯著高于無共培養(yǎng)體系組 28.1%；發(fā)育到 8～16細胞的胚胎比率分別為 49.1%和45.0%，極顯著高于無共培養(yǎng)組 5.7%；囊胚數比率分別為 17.6%、20.0%，極顯著高于對照組；前48 h SOF+BSA后48 h SOF+FCS胚胎培養(yǎng)液更能促進胚胎發(fā)育（囊胚率34.7%）。王艾平等[21]向胚胎培養(yǎng)液中添加亞硫磺酸(HTAU) 研究其對山羊體外胚胎發(fā)育的影響，結果顯示，亞硫磺酸有益于早期胚胎的體外發(fā)育，胚胎培養(yǎng)液中HTAU的優(yōu)選濃度為0.5 mmol/L。張家新等[45]比較了非必需氨基酸（NEAA）、必需氨基酸（EAA）對綿羊體外胚胎的發(fā)育。結果表明，胚胎培養(yǎng)液單獨添加NEAA可明顯提高綿羊胚胎的囊胚發(fā)育率；單獨添加EAA對綿羊桑椹期前的胚胎發(fā)育沒有促進作用，但可以促進囊胚孵化；0.5×EAA+1×NEAA組合的囊胚率和囊胚孵化率最高，分別為44%和33%。武建朝[40]比較了性成熟前山羊受精卵CR1aa和SOFaa胚胎發(fā)育體系，結果表明SOFaa培養(yǎng)系統的卵裂率和桑椹胚囊胚率顯著高于CR1aa培養(yǎng)系統（42% :35.56%，12% : 5.71%）。試驗研究發(fā)現，通過改進胚胎培養(yǎng)液、培養(yǎng)方法，已大幅提高了胚胎體外發(fā)育能力。

4 結語

經過科研人員大量的試驗研究，目前體外受精率有所提高，但對部分卵母細胞和早期胚胎的發(fā)育調節(jié)機理不是很清楚，卵母細胞核質成熟是否真正成熟，其影響到受精和胚胎的發(fā)育；精卵受精過程中，不正常受精情況；受精卵發(fā)育阻斷及胚胎持續(xù)發(fā)育能力等都是制約體外受精技術真正實現推廣應用的瓶頸?？傊窖騃VF技術研究已經取得了重大的進步，還需進一步深入研究IVM、精子處理、IVF、IVC等相關技術環(huán)節(jié)，明確其互相影響機制，優(yōu)化集成技術，才能使其真正走向養(yǎng)殖業(yè)的推廣應用領域。

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S814.3；S826.3

B

1005-2739（2017）01-0007-07

2016-11-03

豆興堂（1978-），男，碩士，高級

畜牧師，主要從事絨山羊繁殖育種與胚胎工程技術研究與推廣工作。E-mail：dou791120@sina.com