倪佳俊, 周 婷, 賴童飛, 李學(xué)鳳, 李宜聰, 柴家樂, 張慧雯, 白雪蓮

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310016)

飛蓬草內(nèi)生真菌的分離及抑菌活性研究

倪佳俊, 周 婷, 賴童飛, 李學(xué)鳳, 李宜聰, 柴家樂, 張慧雯, 白雪蓮

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310016)

以藥用植物飛蓬草(ErigeronacerLinn.)為試驗(yàn)材料，利用平板分離法從飛蓬草各器官內(nèi)共分離出34株內(nèi)生真菌，其中根部12株、莖部6株、葉部16株，分離所得的菌株根據(jù)分子生物學(xué)鑒定方法及聚類分析來確定種屬，其中曲霉屬真菌及青霉屬真菌為飛蓬草中的優(yōu)勢菌，并且青霉屬為飛蓬草根、莖、葉中擁有的共有屬.采用牛津杯法測定其發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性，考察34株內(nèi)生真菌對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、煙草赤星病菌、惡臭假單胞菌、大腸埃希氏菌的抑制作用，結(jié)果顯示，對指示病原菌抑制效果最強(qiáng)的G5、J2、J4菌株分別為產(chǎn)紫青霉、輻毛鬼傘、萊氏野村菌.研究表明飛蓬草內(nèi)生真菌具有豐富的多樣性，并且對病原菌有較強(qiáng)的抑菌活性，在生物農(nóng)藥和醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在開發(fā)應(yīng)用價值.

飛蓬草；內(nèi)生真菌；抑菌活性；分子鑒定

植物內(nèi)生真菌是指在健康植物組織中，對植物沒有引起明顯病害癥狀的真菌，內(nèi)生真菌與宿主植物之間存在和諧的關(guān)系，其主要分布在植物的葉鞘、花、莖、葉片、根等器官[1-2].各種植物中含有豐富的內(nèi)生真菌資源，其中某些內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與植物相同或相似的生物活性物質(zhì)[3].而活性成分在植物中的含量較低，通過植物內(nèi)生真菌來獲得與植物有相同活性成分的方法，不受空間、季節(jié)的限制，優(yōu)勢明顯，有很大的發(fā)展?jié)摿4].目前許多研究者已從具有藥用功能的植物中，分離出內(nèi)生真菌，并且其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有抑菌、抗腫瘤、殺蟲等作用[5-7].此外，還可以從植物中分離獲得新的菌種，對于豐富微生物資源具有重要的意義[8].因此，植物內(nèi)生真菌無論在開發(fā)活性成分還是在發(fā)現(xiàn)新的菌種資源方面都有極高的研究價值.

飛蓬草(ErigeronacerLinn.)又名加拿大蓬、小飛蓬，為菊科越年生或一年生草本植物，原產(chǎn)于北美洲，現(xiàn)在我國廣泛分布[9].飛蓬草作為一種藥用植物，可以產(chǎn)生香草酸、丁香酸、檸檬烯等具有抑菌作用的代謝產(chǎn)物，并且有消炎止血、利尿、治療痢疾等功效[10-11].目前對飛蓬草的研究主要集中在除草活性、抗氧化活性等方面[12-14]，對其內(nèi)生真菌及其對病原菌的抑菌活性研究較少，因此本實(shí)驗(yàn)通過對飛蓬草各器官的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離、鑒定，開展內(nèi)生真菌初步抑菌實(shí)驗(yàn)以及對內(nèi)生真菌發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的抑菌活性進(jìn)行研究，為挖掘飛蓬草內(nèi)生真菌資源奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植株

飛蓬草新鮮健康植株采自于杭州師范大學(xué)藥用植物園，全株采樣后立即用保鮮袋包好，置于保溫盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，24 h內(nèi)進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離.

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)：去皮馬鈴薯200 g切成小塊，加水煮沸20 min,待冷卻后用8層紗布過濾，濾液加入葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，攪拌均勻后再補(bǔ)充水分至1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min.

PDB培養(yǎng)液(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液)：去皮馬鈴薯200 g切成小塊，加水煮沸20 min,待冷卻后用8層紗布過濾，濾液加入葡萄糖20 g，攪拌均勻后再補(bǔ)充水分至1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min.

WA培養(yǎng)基(水瓊脂培養(yǎng)基)：瓊脂4 g，蒸餾水200 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻至50 ℃左右，加入0.4 g氨芐青霉素和0.4 g鏈霉素.

1.1.3 指示菌株

金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC29213)、白色念珠菌(CandidaalbicansATCC10231)、煙草赤星病菌(AlternariaalternateATCC11680)、惡臭假單胞菌(PseudomonasputidaATCC17485)、大腸埃希氏菌(EscherichiacoliATCC25922)，5種病原菌購自中國微生物菌種保藏中心.

1.2 樣品處理

分別取飛蓬草的葉、根、莖用自來水沖洗表面的污物，待自然晾干后，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺，無菌水沖洗3次，75%乙醇浸泡1 min，1%次氯酸鈉消毒浸泡1 min，無菌水沖洗3次以上.吸取0.2 mL最后一次處理飛蓬草的沖洗液，涂布于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d，為確保飛蓬草表面消毒徹底.

1.3 飛蓬草內(nèi)生真菌的分離

將消毒后的飛蓬草樣品用滅菌的解剖刀將根、莖、葉分別截成1 cm左右的小段，呈45°角斜插入WA培養(yǎng)基表面，每個平皿放置3段，28 ℃恒溫培養(yǎng)4～9 d.待菌絲從切口處長出后，挑取菌絲轉(zhuǎn)接至PDA 培養(yǎng)基，進(jìn)行內(nèi)生真菌的劃線分離，重復(fù)劃線直至培養(yǎng)基中長出單一菌落為止.

1.4 內(nèi)生真菌形態(tài)學(xué)鑒定

將分離得到的內(nèi)生真菌接種于PDA培養(yǎng)基，在距離接種點(diǎn)3 cm處，用無菌鑷子將滅菌后的蓋玻片斜插入培養(yǎng)基中，平皿置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，直至菌絲長至蓋玻片約1/2處，取出蓋玻片，放在滴有無菌水的載玻片上，觀察飛蓬草內(nèi)生真菌的顯微形態(tài)以及在培養(yǎng)基上生長的菌落特征形態(tài)，結(jié)合分子鑒定結(jié)果，參照《真菌鑒定手冊》[15]確定菌株的分類學(xué)地位.

1.5 內(nèi)生真菌分子生物學(xué)鑒定

表1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系Tab. 1 PCR amplification reaction system

從平板中刮取各內(nèi)生真菌樣品，分別進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液離心獲得菌絲，按照CTAB 法[16]提取內(nèi)生真菌基因組DNA，采用真菌ITS通用引物，ITS4：(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5： (5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增.按照表1所示反應(yīng)體系，以ITS4和ITS5進(jìn)行PCR反應(yīng)：94 ℃變性5 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min.PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖(濃度為10 g/L)凝膠電泳(150 V恒電壓，20 min)，利用Gel Extraction Kit回收目的片段，以回收的目的片段作為模板，重復(fù)PCR擴(kuò)增.PCR產(chǎn)物利用羅氏PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，送至上海桑尼公司測序，利用BLAST搜索軟件將序列測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)真菌菌株的序列進(jìn)行比對，獲得相似性序列，再用MEGA5.1進(jìn)行鄰接法(neighbor joining)聚類系統(tǒng)發(fā)育分析，從而獲得菌種的分類地位.

1.6 內(nèi)生真菌的抑菌活性

1.6.1 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物制備

將分離獲得的內(nèi)生真菌接種至PDB培養(yǎng)液中，28 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)5 d，將發(fā)酵液以8 000 r·min-1離心10 min獲取上清液.收集的上清液用等體積乙酸乙酯萃取3次，在50 ℃恒溫水浴條件下減壓濃縮至干，稱重.用二甲基亞砜(DMSO)配制成濃度為100 mg/mL的溶液，備用.

1.6.2 抑菌活性測試

采用牛津杯法對內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抑菌活性測試.用接種環(huán)挑取經(jīng)培養(yǎng)2 d的指示病原菌于1 mL無菌水中，搖勻，得病原菌懸菌液.吸取100 μL病原菌懸菌液加入滅菌后未凝固的PDA培養(yǎng)基中，混勻，將牛津杯放置在含有病原菌的平板上.取濃度為100 mg/mL各內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物70 μL加入牛津杯中，以等量DMSO溶劑作為陰性對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)，24～48 h后觀察，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 飛蓬草內(nèi)生真菌的多樣性分析

從飛蓬草植株的根、莖、葉中共分離獲得內(nèi)生真菌34株，不同組織中的內(nèi)生真菌數(shù)量有明顯差異.葉部數(shù)量多，達(dá)16株；根部僅次于葉部，為12株；莖中的內(nèi)生真菌數(shù)量最少，為6株.

通過對各菌株進(jìn)行菌落形態(tài)(表面形態(tài)、大小、質(zhì)地、生長速度、邊緣形態(tài)等)觀察和顯微形態(tài)(孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、有無橫膈等特征)觀察，結(jié)合分子生物學(xué)鑒定結(jié)果.初步將飛蓬草內(nèi)生真菌分為13個屬：曲霉屬(Aspergillus)、酵母屬(Saccharomyces)、毛霉屬(Mucor)、鬼傘屬(Coprinus)、青霉屬(Penicillium)、小菌核屬(clerotium)、串珠霉屬(Monilochaetes)、球座菌屬(Guignardia)、絲核菌屬(Rhizoctonia)、萊氏野村菌屬(Nomuraearileyi)、木霉屬(Trichoderma)、共頭霉屬(Syncephalastrum)、鐮刀菌屬(Fusarium).從表2可知，根部分離出內(nèi)生真菌有7個屬，莖部有4個屬，葉中有9個屬，由此表明飛蓬草不同器官擁有不同內(nèi)生真菌種群，并且存在差異性.從表3可知，曲霉屬真菌及青霉屬真菌從飛蓬草中分離獲得的頻率最高，為優(yōu)勢菌群，其中青霉屬為飛蓬草根、莖、葉擁有的共有屬，兩種屬都有進(jìn)一步研究的潛力.同時飛蓬草根、莖、葉3個不同組織部位，均分離出屬于該組織的特有屬，說明飛蓬草內(nèi)生真菌具有一定的組織?；?

表2 飛蓬草不同部位中內(nèi)生真菌分布Tab. 2 Distribution of the Endophytic fungi from different tissue of Erigeron acer L.

表3 飛蓬草內(nèi)生真菌的形態(tài)特征Tab. 3 Morphological characteristicsof the plant endophytic fungi from Erigeron acer L.

2.2 飛蓬草內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性

將獲得的34株內(nèi)生真菌，通過牛津杯法進(jìn)行內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性測定，其中對指示病原菌有抑菌作用的內(nèi)生真菌共有14株，占分離獲得內(nèi)生真菌數(shù)目的41.2%(見表4).從莖中分離所得J1、J2、J4內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物，對3株指示病原菌有顯著抑菌活性；而部分內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物只對單一指示病原菌有明顯抑制作用，表現(xiàn)為抑菌專一性.根據(jù)抑菌活性實(shí)驗(yàn)，有9株飛蓬草內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物對大腸埃希氏菌有抑制作用；但僅有2株內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物對煙草赤星病菌有抑制作用.在所有內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物中，G5、J2、J4的發(fā)酵產(chǎn)物分別對煙草赤星病菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大于20 mm，有較強(qiáng)的抑菌活性，其組分分析、抑菌機(jī)理等有待進(jìn)一步研究.

2.3 分子生物學(xué)鑒定及聚類分析

對指示病原菌有抑制作用的14株飛蓬草內(nèi)生真菌序列，輸入NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，并將有最高比對度的菌株及匹配編號列于表4中.最終，飛蓬草內(nèi)生真菌序列與比對后獲得相似度較高的菌株序列，錄入MEGA 5.1軟件進(jìn)行聚類分析，并且采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

根據(jù)比對結(jié)果，對指示病原菌有抑制效果的飛蓬草內(nèi)生真菌分別屬于7個屬：曲霉屬、青霉屬、木霉屬、鐮刀菌屬、鬼傘屬、共頭霉屬、萊氏野村菌屬，NCBI匹配編號見表5.而根據(jù)比對結(jié)果及聚類分析結(jié)果，結(jié)合菌落形態(tài)特征，基本能夠?qū)⑺芯觇b定到種，但是仍有部分菌株只能鑒定到屬.從根部分離獲得的G2和G10，聚類分析結(jié)果與ITS序列分析結(jié)果并不完全一致，辨別程度低，因而僅僅能夠鑒定為曲霉屬；從莖部分離獲得的J1，鑒定為共頭霉屬；從葉部分離獲得的Y5和Y14，鑒定為青霉屬真菌.其中對指示病原菌抑制效果最強(qiáng)的G5、J2、J4菌株分別為產(chǎn)紫青霉、輻毛鬼傘、萊氏野村菌.對指示病原菌有抑制效果的飛蓬草內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1-圖3所示.

表4 飛蓬草內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性Tab. 4 Fermentation products antimicrobial activity of fungal endophytes isolated from Erigeron acer L.

注：—表示無抑菌作用.

表5 NCBI數(shù)據(jù)庫匹配結(jié)果Tab. 5 NCBI database matching results

圖1 飛蓬草根部內(nèi)生真菌聚類分析圖(NJ法構(gòu)建)Fig. 1 NJ Analysis of sequences offungal endophytesisolated from root of Erigeron acer L.

圖2 飛蓬草莖部內(nèi)生真菌聚類分析圖(NJ法構(gòu)建)Fig. 2 NJ Analysis of sequences offungal endophytesisolated fromstem of Erigeron acer L.

圖3 飛蓬草葉部內(nèi)生真菌聚類分析圖(NJ法構(gòu)建)Fig. 3 NJ Analysis of sequences offungal endophytes isolated from leaves of Erigeron acer L.

3 討 論

飛蓬草是一種重要的藥用植物，對其抑菌作用的研究還處在初級階段.本研究從飛蓬草根、莖、葉中分離出34株內(nèi)生真菌，表明飛蓬草的內(nèi)生真菌具有生物多樣性，是豐富的微生物資源庫.本實(shí)驗(yàn)可以通過改進(jìn)分離方式、處理?xiàng)l件來獲取更多數(shù)量的內(nèi)生真菌.另一方面，青霉菌屬和曲霉菌屬內(nèi)生真菌為飛蓬草的優(yōu)勢菌，其中青霉菌屬在根、莖、葉部均分離獲得，但部分菌屬只在特定組織中存在，由此可見在飛蓬草的不同部位存在一定的特異性.其中青霉菌屬的繁殖能力快，菌絲初為白色，漸變?yōu)榫G色、墨綠色，邊緣帶有一圈白色菌絲，生長較為致密，為綠色粉末孢子，正反面顏色不同，背面呈現(xiàn)橙色.曲霉菌屬匍匐于基質(zhì)并且菌絲呈現(xiàn)向空中伸出球形或橢圓形頂囊的分生孢子梗，在培養(yǎng)基生長較快，表面有放射狀溝紋.

當(dāng)前，對煙草赤星病菌的抑制研究主要集中在化學(xué)藥劑防治[17].但由于化學(xué)藥劑防治方法容易受環(huán)境等因素的干擾，易被沖刷而失效，并有化學(xué)農(nóng)藥殘留等問題，且目前治療大腸埃希氏菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、惡臭假單胞菌感染的藥物因長期使用，其耐藥性提高[18-20]，因而通過生物防治方法，分離和篩選對病原菌有良好抑制效果的微生物及其發(fā)酵產(chǎn)物是一種重要的替代方法.

飛蓬草內(nèi)生真菌抑菌實(shí)驗(yàn)表明，分離所獲得菌株的發(fā)酵產(chǎn)物對不同指示病原菌的抑制效果差別較大，其中對煙草赤星病菌有抑制效果的菌株僅含2株，而大多數(shù)分離菌株的發(fā)酵產(chǎn)物對大腸埃希氏菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌有較明顯抑制效果.有研究表明，不同菌株的抑菌活性與其代謝產(chǎn)物，如生物堿、酚類及其有機(jī)酸類等有關(guān)[21-23].本實(shí)驗(yàn)僅僅考察內(nèi)生真菌發(fā)酵所得次級代謝產(chǎn)物對指示病原菌的抑制作用，下一步可對其抑菌能力作進(jìn)一步分析，并且代謝產(chǎn)物的組成及其化學(xué)結(jié)構(gòu)還需進(jìn)一步研究，從而挖掘出擁有較強(qiáng)抑菌能力的化學(xué)成分.

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Isolation of Endophytic Fungi fromErigeronAcerL. and
Antimicrobial Activities

NI Jiajun, ZHOU Ting, LAI Tongfei, LI Xuefeng, LI Yicong, CHAI Jiale,ZHANG Huiwen, BAI Xuelian

(College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310016, China)

Investigation on biodiversity of endophytic microbes associated withErigeronacerL. is carried out in this work. Using the method of plate separation, a total of 34 fungal strains are isolated from the organs ofE.acerL., which twelve endophytic strains are from root, six strains from stem, and sixteen strains from leaf.AspergillusandPenicilliumare the predominant fungi inErigeronacerL.,ErigeronacerL. roots, stems and leaves have common genera——Penicillium. Using Oxford cup method, its antibacterial activity is measured, and the inhibition of 34 strains of fungi onStaphylococcusaureus,Moniliaalbican,lternariaalternata,PseudomonasputidaandEscherichiacoliis investigated. The results show that the G5, J2, J4 strains with the strongest inhibition arePenicilliumpurpurogenum,Coprinusradians,Nomuraearileyi. This study shows thatErigeronacerL. endophytic fungi has abundant diversity, and has strong antibacterial activity against pathogenic bacteria.

ErigeronacerL.; endophytic fungi; antimicrobial activity; molecular identification

2016-09-17

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LQ14C200005；LY16H300007)；杭州市科技發(fā)展計劃項(xiàng)目(20140432B02)；2016年國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃(201610346024)；2016-2017學(xué)年“本科生創(chuàng)新能力提升工程”重點(diǎn)項(xiàng)目(201610346024)；2016-2017學(xué)年“本科生創(chuàng)新能力提升工程”一般項(xiàng)目(cx2016110)；2016學(xué)年實(shí)驗(yàn)室開放項(xiàng)目;杭州師范大學(xué)第17屆“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽項(xiàng)目.

白雪蓮(1978—),女，講師，博士，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā).E-mail:baixl2012@163.com

10.3969/j.issn.1674-232X.2017.01.015

Q939.5

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1674-232X(2017)01-0057-07