歐紅萍，楊海涵，楊 敏，陳 淼

（1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川 溫江 611130；2.四川乾坤生物技術(shù)研究中心，四川 溫江 611130）

人工誘導(dǎo)家兔實驗性乳房炎模型的建立

歐紅萍1，楊海涵2，楊 敏1，陳 淼1

（1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川 溫江 611130；2.四川乾坤生物技術(shù)研究中心，四川 溫江 611130）

將48只分娩后7d的健康新西蘭泌乳家兔隨機分成空白對照組 （T1組）、金黃色葡萄球菌組（T2組）和大腸桿菌組（T3組），分別按每個乳腺0.5mL量向家兔乳頭管內(nèi)灌注無菌肉湯、金黃色葡萄球菌菌液和大腸桿菌菌液，并于灌注前2h和灌注后6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d，采集家兔耳緣靜脈血和乳腺組織，測定全血中WBC、LYM和GRA總數(shù)以及血清中CRP含量。結(jié)果顯示：家兔血液中WBC、LYM和GRA總數(shù)出現(xiàn)了相應(yīng)的變化，T2組和T3組血清中的CRP含量有相應(yīng)程度的升高，表明機體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。

家兔乳房炎模型；急性期蛋白；鈣粒結(jié)合蛋白-C

乳房炎是奶牛業(yè)生產(chǎn)中危害最大的疾病之一。目前，通過動物模型進行乳房炎的研究是解決細(xì)菌性奶牛乳房炎發(fā)病的重要手段。利用奶牛、奶山羊和大鼠等動物建立乳房炎模型有一定的局限性，家兔和奶牛同屬于哺乳動物，應(yīng)用泌乳家兔建立奶牛乳房炎模型，可能會以較低的成本獲得更多的試驗材料。因此，本研究通過在家兔乳頭管灌注金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，觀察灌注后家兔的臨床病理變化，以確定是否能建立家兔乳房炎模型。

1 試驗材料

1.1 試驗動物 初產(chǎn)，健康，體重3.5kg左右，懷孕15d左右的新西蘭母兔48只（購于四川省名山縣某大型兔場），常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 主要儀器和試劑 Abacus junior血球分析儀（奧巴克斯公司，奧地利）；全自動生化分析儀（AMS公司，意大利）；C-反應(yīng)蛋白測定試劑盒（邁克生物有限公司）。

2 試驗方法

2.1 菌液配制及灌注方法 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均從患病奶牛乳汁中分離純化，然后配成菌液，甘油冷凍保存，使用前解凍進行細(xì)菌計數(shù)，細(xì)菌濃度為3×105CFU/mL。將48只母兔隨機分成3組，每組16只，分別為空白對照組（T1組）、金黃色葡萄球菌組（T2組）和大腸桿菌組（T3組），大腸桿菌組和金黃色葡萄球菌組分別注入0.5mL計數(shù)過的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液，空白對照組注入滅菌肉湯[1]。

母兔分娩后自然哺乳，7d后接種菌液。接種方法：先將母兔保定，用75%酒精對第三對乳腺區(qū)域消毒，然后用1mL注射器輕輕刺破皮膚沿乳頭管插入，注入0.5mL含菌數(shù)為1.5×105CFU的菌液。

2.2 血樣采集 采血的時間點為灌注菌液前2h，灌注后6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d，采集母兔耳緣靜脈血，將全血分兩份，一份全血用EDTA抗凝劑抗凝，用于血常規(guī)測定；一份于3000r/min離心15min分離血清，-20℃保存，用于血清CRP測定。

2.3 測定指標(biāo)及方法

2.3.1 WBC、LYM、GRA數(shù)量測定 采用Abacus junior血球分析儀測定全血白細(xì)胞（WBC）、淋巴細(xì)胞（LYM）及中性粒細(xì)胞（GRA）總數(shù)[2]。

2.3.2 C反應(yīng)蛋白（CRP）含量測定 按C反應(yīng)蛋白測定試劑盒說明操作，以標(biāo)準(zhǔn)品220、64.8、20.7、6.1、0.0mg/L為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程，從而計算出樣品中的CRP含量[3]。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 應(yīng)用Excel（2003）軟件整理數(shù)據(jù)，用Spss13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行一維方差分析和t檢驗。所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 生理指標(biāo)時相的變化 母兔血液白細(xì)胞（WBC）總數(shù)的動態(tài)變化：白細(xì)胞總數(shù)在接種金黃色葡萄球菌后開始緩慢下降，48h時開始顯著下降（P＜0.05）；在接種大腸桿菌后6h時開始顯著下降（P＜0.05），之后緩慢回升，72h時恢復(fù)到接種前水平；空白對照組變化不明顯。金黃色葡萄球菌組與空白對照組在48h、5 d和7 d時差異顯著（P＜0.05），與大腸桿菌在6 h、12 h、5d和7 d時差異顯著（P＜0.05），大腸桿菌組與空白對照組在6～48h差異顯著（P＜0.05）。血液淋巴細(xì)胞總數(shù)的變化：淋巴細(xì)胞在接種金黃色葡萄球菌后顯著下降（P＜0.05），6h時下降到最低點，之后緩慢回升，72h時恢復(fù)到接種前水平，之后又顯著升高（P＜0.05）；在接種大腸桿菌后顯著下降（P＜0.05），之后緩慢回升，24h時恢復(fù)到接種前水平，之后又緩慢下降，5～7d時顯著下降（P＜0.05）；空白對照組變化不明顯。金黃色葡萄球菌組與大腸桿菌組在12～48h、5d和7d時差異顯著（P＜0.05），與對照組在6～24h、5d和7d時差異顯著（P＜0.05），大腸桿菌組與對照組在6 h、24 h、5d和7d時差異顯著（P＜0.05）。血液中性粒細(xì)胞總數(shù)的變化：中性粒細(xì)胞數(shù)在接種金黃色葡萄球菌后開始緩慢升高，24 h時升高較接種前顯著（P＜0.05），之后緩慢下降，72h后顯著下降（P＜0.05）；在接種大腸桿菌后6h時開始顯著下降（P＜0.05），24h時下降到最低點，之后恢復(fù)到接種前水平；空白對照組變化不明顯。金黃色葡萄球菌組與空白對照組在48h時差異顯著（P＜0.05），與大腸桿菌在6～24h、5d和7d時差異顯著（P＜0.05），大腸桿菌組與空白對照組在6～48h差異顯著（P＜0.05）。

以上血液中炎性細(xì)胞的動態(tài)變化反映了家兔乳房炎癥的發(fā)展過程（表1）。

3.2 血清中CRP含量的動態(tài)變化 血清中CRP含量在接種金黃色葡萄球菌后開始慢慢上升，24 h和48h時升高較顯著（P＜0.05），之后緩慢下降到接種前水平；在接種大腸桿菌后48h時顯著升高（P＜0.05），之后緩慢下降到接種前水平；空白對照組在接種無菌肉湯后持續(xù)升高，72h時開始顯著升高（P＜0.05）。金黃色葡萄球菌組與空白對照組在24～48h和5～7d時差異顯著（P＜0.05），與大腸桿菌組差異不顯著（P＞0.05），大腸桿菌組與空白對照組在24～48h和5～7d時差異顯著（P＜0.05）（表2）。

表1 灌注金黃色葡萄球菌和大腸桿菌前后家兔血液中WBC、LYM和GRA總數(shù)的動態(tài)變化

表2 灌注金黃色葡萄球菌和大腸桿菌前后家兔血清中CRP含量的動態(tài)變化

4 討論

乳房炎常發(fā)生于奶牛[4]或奶山羊，研究乳房炎的發(fā)病機理、篩選敏感的奶牛乳房炎防治藥物等，都需要一種典型、廉價、易于建立的乳房炎動物模型。本試驗通過血液中炎性細(xì)胞計數(shù)來反映炎癥的發(fā)展進度，通過CRP含量測定來顯示機體炎癥的發(fā)生情況，根據(jù)這些指標(biāo)和家兔臨床表現(xiàn)的結(jié)合，可推導(dǎo)出1.5×105CFU/0.5mL金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均可引起家兔乳房炎癥。

在絕大多數(shù)情況下白細(xì)胞的增多或減少，主要受中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的影響，在急性感染，特別是化膿性球菌（如金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌）感染時，白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)增多[5]。金黃色葡萄球菌組白細(xì)胞的減少是淋巴細(xì)胞參與體液免疫消耗減少所致，在革蘭氏陰性細(xì)菌感染時，白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)減少[6]，這和大腸桿菌組的結(jié)果一致。

CRP不具有特異性，但卻是在急性時相反應(yīng)中變化較敏感的急性時相蛋白質(zhì)[7]。對于已感染金黃色葡萄球菌乳房炎的奶牛，在感染期間CRP含量會增高，并與畜群的健康狀況有一定的相關(guān)性。本試驗通過測定血清中CRP含量變化來分析家兔乳房炎炎癥的發(fā)展程度，結(jié)果表明，在機體出現(xiàn)炎癥時，血清中CRP含量相應(yīng)升高，但T1組72h時顯著升高（P＜0.05），升高幅度是T2和T3組的2～6倍，這與已有報道不符[8]?？赡芘c測定方法有關(guān)，也可能與試驗材料選取有關(guān)，因為活菌和單一毒素存在很大差別，因而造成機體內(nèi)蛋白反應(yīng)不同。本試驗同時證明了血清CRP含量受很多因素的影響。

5 結(jié)論

通過乳頭管灌注1.5×105CFU/0.5 mL金黃色葡萄球菌和大腸桿菌誘導(dǎo)家兔乳房炎模型建立成功，且主要是局部乳房炎癥。

[1]鐘凱，王艷玲，鄒思湘，等.乳頭管灌注內(nèi)毒素誘發(fā)大鼠實驗性乳房炎模型的建立[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2005，13（5）：654-658.

[2]苗晉鋒，馬海田，鄒思湘，等.內(nèi)毒素對山羊乳腺組織中與乳腺炎相關(guān)的酶和細(xì)胞因子的影響[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，36（6）：608-613.

[3]劉滌潔，馮淇輝，陳杖榴.恩諾沙星在健康及實驗性感染乳房炎奶山羊間的比較藥動學(xué)[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36（9）：1100-1104.

[4]楊德英.奶牛乳房炎對乳酶活性、急性期蛋白含量的影響及其作為隱性乳房炎診斷指標(biāo)的研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009：39-46.

[5]楊永新，趙興緒，張勇，等.臨床型乳房炎與正常奶牛血漿的差異蛋白質(zhì)組研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（7）：2162-2167.

[6]楊永新，張勇，周雷，等.奶牛乳房炎乳腺膜蛋白的比較蛋白質(zhì)學(xué)研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（18）：3 862-3868.

[7] Leung W，Chan C P，Rainer T H，et al.Infect Check CRP barcode-style lateral flow assay for semi-quantitative detection of C-reactive protein in distinguishing between bacterial and viral infections [J].JournalofImmunologicalMethods，2008，336（1）：30-36.

[8] Donaszi I A，Scharek P，F(xiàn)alus A，et al.Hepatic acute-phasereaction in histamine-deficient gene targeted mice[J].Inflammopharmacology，2004，12（1）：47-55.

S858.291.26

：B

：1001-8964（2017）01-0028-03

2016-11-28

歐紅萍（1980-），男，重慶墊江人，研究生，講師，主要從事草食動物的疾病防治及繁殖障礙研究。