鐘洪蘭，李 祥，孟繁榮，李 衛(wèi)，黃華英（.廣州市胸科醫(yī)院藥劑科，廣州 50095；.廣州市胸科醫(yī)院肺部疾病研究所，廣州 50095）

·精準醫(yī)療·

抗結(jié)核藥物性肝損害與CYP2E1和GSTM1基因多態(tài)性的相關(guān)性研究Δ

鐘洪蘭1＊，李 祥1，孟繁榮2，李 衛(wèi)1，黃華英1（1.廣州市胸科醫(yī)院藥劑科，廣州 510095；2.廣州市胸科醫(yī)院肺部疾病研究所，廣州 510095）

目的：分析抗結(jié)核藥物性肝損害（ADIH）與細胞色素P450酶（CYP）2E1和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）M1基因多態(tài)性的相關(guān)性，并探討其易感因素。方法：選擇我院2011年10月－2015年6月收治的我國南方漢族肺結(jié)核住院患者91例，根據(jù)治療過程中是否出現(xiàn)ADIH將其分為ADIH組（34例）和無ADIH組（57例）；抽取患者外周靜脈血，分別采用聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）和多重PCR法檢測其CYP2E1和GSTM1基因多態(tài)性，采用Logistic回歸分析考察ADIH的易感因素。結(jié)果：所有患者CYP2E1基因型均為c2/c2型（100%）；GSTM1基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。ADIH組GSTM1（＋/－）基因型患者有9例（26.5%），GSTM1（－/－）基因型患者有25例（73.5%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；無ADIH組GSTM1（＋/－）基因型患者有17例（29.8%），GSTM1（－/－）基因型患者有40例（70.2%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；但GSTM1（＋/－）和（－/－）基因型在兩組患者中的分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，患者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)和GSTM1基因型與ADIH均無相關(guān)性（P＞0.05）。結(jié)論：患者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)和GSTM1基因型可能與ADIH無關(guān)。由于僅檢出1種CYP2E1基因型，尚無法判斷其多態(tài)性與ADIH的相關(guān)性。

抗結(jié)核藥物性肝損害；CYP2E1；GSTM1；基因多態(tài)性；相關(guān)性

目前，結(jié)核病仍然是嚴重威脅人類健康的疾病，全球有約20億人感染結(jié)核，每年新發(fā)結(jié)核患者超過900萬人，其中約130萬死于結(jié)核或其并發(fā)癥[1]。我國的結(jié)核防控情況亦不樂觀。2010年，我國15歲以上人群中活動性肺結(jié)核的患病率為459/10萬，涂陽肺結(jié)核患病率為66/10萬[2]。該癥治療需長時間聯(lián)用多種抗結(jié)核藥物，易產(chǎn)生多種藥品不良反應(yīng)（ADR），以藥物性肝損害最為常見[3]，其高發(fā)生率及嚴重程度常使抗結(jié)核治療中斷，是細菌耐藥和抗結(jié)核治療失敗的主要原因。抗結(jié)核藥物性肝損害（Antitubercular drug-induced hepatic-injury，ADIH）與體內(nèi)代謝酶系統(tǒng)密切相關(guān)[4]。由于肝臟中的細胞色素P450酶（CYP）2E1、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）M1和T1、轉(zhuǎn)運蛋白（MRP）2等均參與了ADIH的病理過程[5-6]，且代謝酶的基因分型在不同地域、人群間存在差異，故檢測其基因分型或許可以較為準確、全面地預(yù)測在抗結(jié)核治療過程中是否會出現(xiàn)ADIH。因此，本研究通過檢測我國南方漢族肺結(jié)核患者的CYP2E1和GSTM1的基因分型，初步探討ADIH與其基因多態(tài)性的相關(guān)性，旨在為結(jié)核患者的個體化治療提供參考。

1 材料

1.1 儀器

C1000TMThermal Cycler聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增儀、Gel DocTMXR+ImagineSystem凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；DL-600C型DNA水平電泳儀（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）；Centrifuge 5417C型離心機（德國Eppendorf公司）；DRP-9802型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實驗儀器有限公司）；MilliQ BiacelTMA10TM型純水儀（美國MilliPORE公司）。

1.2 藥品與試劑

通用基因組DNA提取試劑盒[批號：DV811A，包含核糖核酸酶（RNase）A1、溶劑A、溶劑B、溶劑C、溶劑緩沖液、洗液A、洗液B、洗脫緩沖液和核酸純化柱]、DNA聚合酶（配套10×PCR Buffer、dNTP Mixture和TaKaRa Ex Taq系列，批號：RR001A）、AfaⅠ限制性內(nèi)切酶[配套AfaⅠ10×緩沖液和0.1%牛血清白蛋白（BSA），批號：1080S]、100 bp DNA條帶（DNA Ladder，批號：3422B）均購自寶生物工程（大連）有限公司；SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒[生工生物工程（上海）有限公司，批號：SK8142]；瓊脂糖粉（香港基因有限公司，批號：111935）；Gold View核酸染料（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，批號：DH392-5）。

2 方法

2.1 研究對象

選擇我院2011年10月－2015年6月確診為肺結(jié)核、祖輩3代及父母雙方均為漢族且在我國南方（廣東、廣西、湖南、湖北、江西、福建）生活的住院患者。結(jié)核病診斷依據(jù)結(jié)核病分類診斷標準[7]，ADIH診斷參照有關(guān)藥物性肝病的診斷標準[8]及因果關(guān)系評價法（RUCAM）。排除罹患肝病、心力衰竭、呼吸衰竭、菌血癥等可能引起肝臟損傷疾病者，抗結(jié)核治療前丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）或膽紅素升高者及拒絕參與試驗的患者。本研究共納入肺結(jié)核患者91例，根據(jù)治療過程中是否出現(xiàn)ADIH分為ADIH組和無ADIH組，分別為34和57例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

2.2 基因型檢測與分析

2.2.1 DNA的提取 抽取患者外周靜脈血250 μL，按DNA提取試劑盒說明書操作，提取患者DNA。方法如下：取全血250 μL至收集管中，加入溶劑A 500 μL，加入RNase A1 1 μL，振蕩15 s，冰浴5 min；加入溶劑B 4 000 μL，加入4℃溶劑C 1 mL，以離心半徑16 cm、轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心2 min（下同）；棄去上層有機相，再加入4℃溶劑C 1 mL，充分混勻后，離心；將水相轉(zhuǎn)移至收集管中的過濾杯內(nèi)，離心；在濾液中加入溶劑緩沖液400 μL，混勻；將其轉(zhuǎn)移至試劑盒中的核酸純化柱中，離心1 min，棄去濾液；重復(fù)沖洗過程1次。將離心后的核酸純化柱置于另一1.5 mL離心管中，于純化柱膜中央處加入洗脫緩沖液50～200 μL，室溫下靜置1 min，離心，洗液置于－20℃冷凍保存，備用。具體方法按說明書進行。

2.2.2 擴增引物 CYP2E1、GSTM1基因擴增所需引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。CYP2E1引物分別為5′-CCA-GTCGAGTCTACATTGTCA-3′（上游引物）、5′-TTCATTCTGTCTTCTAACTGG-3′（下游引物）；GSTM1引物分別為5′-CTGCCCTACTTGATTGATGGG-3′（上游引物）、5′-CTGGATTGTAGCAGATCATGC-3′（下游引物）；內(nèi)參引物分別為5′-GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG-3′（上游引物）、5′-GCTCACTCAGTGTGGCAAAG-3′（下游引物）。

2.2.3 CYP2E1基因擴增及酶切 采用PCR法擴增CYP2E1基因。PCR反應(yīng)總體積為50 μL，包括5 U/μL TaKaRaEx Taq 0.5 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP Mixture 4 μL、DNA模板1 μL、上游引物及下游引物各2 μL、滅菌蒸餾水35.5 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，62℃退火45 s，72℃延伸45 s，循環(huán)35次；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物各取4 μL經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像儀中觀察結(jié)果。酶切反應(yīng)體系為AfaⅠ1 μL、10×緩沖液2 μL、0.1%BSA 2 μL、DNA 1 μg，加雙蒸水補足至20 μL。酶切條件：37℃下靜置1 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2.2.4 GSTM1基因擴增 采用多重PCR法擴增GSTM1基因與Beta內(nèi)參。PCR反應(yīng)總體積為50 μL，包括5 U/μL TaKaRa Ex Taq 0.5 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP Mixture 4 μL、DNA模板1 μL、上游引物及下游引物各2 μL、滅菌蒸餾水35.5 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，62℃退火45 s，72℃延伸45 s，循環(huán)35次；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物各取4 μL經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，計數(shù)資料以頻數(shù)或百分比表示。采用χ2檢驗判斷CYP2E1、GSTM1基因型分布是否符合Hardy-Weiberg平衡；采用t檢驗比較不同患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)間的差異，采用Logistic回歸分析ADIH的易感因素。

3 結(jié)果

3.1 患者一般情況

ADIH組患者34例，其中男性29例、女性5例，年齡16～83歲，平均年齡（46.7±18.1）歲，體質(zhì)量指數(shù)（19.1± 2.1）kg/m2；無ADIH組患者57例，其中男性43例、女性14例，年齡15～89歲，平均年齡（49.7±19.9）歲，體質(zhì)量指數(shù)（17.4±2.8）kg/m2。兩組患者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

3.2 基因型分型

按“2.2.3”項下條件進行試驗得PCR擴增產(chǎn)物酶切片段的長度為360、50 bp。共檢出CYP2E1基因型1種，即CYP2E1 c2/c2（突變型純合子）。CYP2E1基因擴增酶切后電泳結(jié)果見圖1。

圖1 CYP2E1基因擴增酶切后電泳結(jié)果Fig 1 Electrophoresis results of CYP2E1 gene amplification and enzyme restriction

按“2.2.4”項下條件進行試驗得多重PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳片段的長度為536、273 bp。共檢出GSTM1基因型2種，分別為GSTM1（－/－）（缺失型，536 bp）和GSTM1（+/－）（非缺失型，536、273 bp）。GSTM1基因凝膠電泳圖見圖2。

圖2 GSTM1基因凝膠電泳圖Fig 2 Gel electrophoresis pattern of GSTM1 gene

3.3 基因型分布

3.3.1 CYP2E1基因型分布 兩組患者CYP2E1基因型均為c2/c2型（100%）。

3.3.2 GSTM1基因型分布 ADIH組GSTM1（+/－）基因型患者有9例（占26.5%），（－/－）基因型患者有25例（占73.5%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；273 bp與536 bp條段基因頻率分別為0.13和0.87。無ADIH組GSTM1（+/－）基因型患者有17例（占29.8%），（－/－）基因型患者有40例（占70.2%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；273 bp與536 bp條段基因頻率分別為0.15和 0.85。兩組患者GSTM1基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（χ2分別為0.79、1.75，P＞0.05），提示樣本來自遺傳平衡群體，有較好的代表性；但GSTM1（+/－）和（－/－）基因型在兩組患者中的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3.4 ADIH易感因素分析

Logisitic回歸分析結(jié)果顯示，患者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)和GSTM1基因型與ADIH均無相關(guān)性（P＞0.05）。各因素與ADIH的相關(guān)性見表1。

表1 各因素與ADIH的相關(guān)性Tab 1 The association of different factors withADIH

4 討論

CYP2E1可將異煙肼水解成有肝毒性的乙酰煙肼，導(dǎo)致肝細胞損傷和壞死。研究發(fā)現(xiàn)，CYP2E1 c1/c1基因型與肝損害的發(fā)生呈正相關(guān)[9]。CYP2E1基因型在不同人群中存在不同的分布特點[10]，突變型純合子（c2/c2基因型）較為少見，但本研究所選的患者基因型均為突變型純合子。本研究納入的病例均為隨機選擇，出現(xiàn)這樣的結(jié)果可能與其所處地域有關(guān)。由于研究病例均為c2/ c2基因型，故在ADIH易感因素分析中，并未考慮CYP2E1基因多態(tài)性。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，患者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)和GSTM1基因型與ADIH無相關(guān)性。GST酶是體內(nèi)重要的Ⅱ相代謝酶，在抗結(jié)核藥物的解毒和代謝中發(fā)揮著重要的作用；GSTM1或GSTT1基因缺失會導(dǎo)致該基因無法編碼相應(yīng)蛋白，對應(yīng)的酶活性消失，從而使藥物毒性代謝產(chǎn)物和還原型谷胱甘肽結(jié)合發(fā)生障礙，引起肝細胞損害或壞死[11]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，GSTM1基因缺失型是患者發(fā)生ADIH的高危因素[12]；但也有研究表明，GSTM1基因型與肝損害的發(fā)生無顯著性關(guān)系[13]。出現(xiàn)這種情況可能與GSTM1和T1酶存在底物交叉現(xiàn)象有關(guān)?？菇Y(jié)核藥物的毒性產(chǎn)物被GSTM1酶解毒，但也有部分會被GSTT1酶解毒，因此會出現(xiàn)GSTM1基因與ADIH相關(guān)性的不同結(jié)論。由于本課題組試驗條件的限制，本研究未對GSTT1基因多態(tài)性進行檢測。此外，Ⅱ相代謝酶中的N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶-2（NAT2）和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGT）在對毒性物質(zhì)的轉(zhuǎn)移方面也起著重要的作用，且具有NAT2慢乙酰基因（NAT2*6A/*7B）和GSTM1基因缺失型的患者發(fā)生ADIH的概率比只攜帶1種基因型的患者要高，也進一步提示毒性物質(zhì)的轉(zhuǎn)移受多種酶的影響[14-15]。因此，不同研究會因人群、種族及其基因型的差異而產(chǎn)生不同的結(jié)論。本研究結(jié)果顯示，雖然ADIH組和無ADIH組GSTM1基因缺失型患者均多于非缺失型患者，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），可能與本研究并未綜合考慮所選患者NAT2基因分型、樣本量較少等因素有關(guān)。

綜上所述，本研究考察了我國南方漢族人群中CYP2E1和GSTM1基因型與ADIH的關(guān)系，但未發(fā)現(xiàn)GSTM1基因缺失與ADIH的發(fā)生相關(guān)；由于本研究所有患者的CYP2E1基因型均一致，故尚無法判斷兩者的相關(guān)性。肝損害的發(fā)生過程受多種代謝酶（如GSTT1、NAT2、UGT等酶）的影響，其編碼基因也都存在多態(tài)性，這些酶之間是否存在關(guān)聯(lián)性值得深入探討；同時，本研究也提示，足夠的樣本量和多種基因型的綜合分析可能會對揭示ADIH的機制具有更大的幫助。

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Association ofAntituberculosis Drug-induced Hepatotoxicity with CYP2E1 and GSTM1 Gene Polymorphisms

ZHONG Honglan1，LI Xiang1，MENG Fanrong2，LI Wei1，HUANG Huaying1（1.Dept.of Pharmacy，Guangzhou Chest Hospital，Guangzhou 510095，China；2.Institute of Lung Disease，Guangzhou Chest Hospital，Guangzhou 510095，China）

OBJECTIVE：To analyze the association of antituberculosis drug-induced hepatotoxicity（ADIH）with gene polymorphisms of cyptochrome P450（CYP）2E1 and glutathione-S-transferase（GST）M1，and to discuss susceptibility factor.METHODS：91 southern and Han inpatients with tuberculosis were selected from our hospital during Oct.2011-Jun.2015.According to the occurrence of ADIH，those patients were divided into ADIH group（34 cases）and non-ADIH group（57 cases）.Peripheral venous blood of patients were collected，PCR and multiple PCR were used to detect CYP2E1 and GSTM1 gene polymorphisms.The susceptibility factors of ADIH was investigated by Logistic regression analysis.RESULTS：CYP2E1 genotype of all patients were c2/c2 genotype（100%），and GSTM1 genotype distribution met Hardy-Weinberg balance（P＞0.05）.There were 9 patients（26.5%）with GSTM1（+/－）genotype and 25 patients（73.5%）with GSTM1（－/－）genotype in ADIH group，with statistical significance（P＜0.05）.There were 17 patients（29.8%）with GSTM1（+/－）genotype and 40 patients（70.2%）with GSTM1（－/－）genotype in non-ADIH group，with statistical significance（P＜0.05）.There was no statistical significance in the distribution of GSTM1（+/－）and（－/－）genotype between 2 groups（P＞0.05）.Logistic regression analysis showed that there was no correlation of gender，age，BMI and GSTM1 genotype with ADIH（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Gender，age，BMI and GSTM1 genotype may be not correlated with ADIH；The relationship of GSTM1 genotype with ADIH can not be judged because only one kind of CYP2E1 genotype has been detected.

Antituberculosis drug-induced hepatotoxicity；CYP2E1；GSTM1；Gene polymorphisms；Association

R968

A

1001-0408（2017）02-0149-04

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項目（No.A2011498）

＊主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：020-83595977。E-mail：zhonghong1206@21cn.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.02.02