信小娟，孫海峰，李玉成，叢建華

(大興安嶺林業(yè)集團(tuán)公司農(nóng)業(yè)林業(yè)科學(xué)研究院，黑龍江加格達(dá)奇165000)

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基質(zhì)濕度對黃芪幼苗防御應(yīng)答及根際微生物的影響

信小娟，孫海峰，李玉成，叢建華

(大興安嶺林業(yè)集團(tuán)公司農(nóng)業(yè)林業(yè)科學(xué)研究院，黑龍江加格達(dá)奇165000)

通過考察基質(zhì)濕度對黃芪幼苗防御應(yīng)答及根際微生物的影響，了解土壤水分在黃芪藥材品質(zhì)形成中的可能作用。采用滲灌控水方式控制盆栽黃芪基質(zhì)水分，分光光度法測定黃芪幼苗根、莖、葉綠葉揮發(fā)物(green leaf volatiles, GLVs)合成途徑關(guān)鍵酶——脂肪氧合酶(lipoxygenase, LOX)和苯丙烷類類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶——苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin ammonia-lyase, PAL)活性和總黃酮含量，梯度稀釋法測定根際細(xì)菌和真菌數(shù)量，SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明，高水分含量(81.6%)導(dǎo)致黃芪幼苗根際微生物數(shù)量顯著下降，葉PAL和根LOX活性顯著升高，但根中的總黃酮含量明顯低于低濕度組的。相比較而言，低濕度組黃芪根際真菌和細(xì)菌數(shù)量無明顯變化，且葉LOX活性較高?；|(zhì)水分含量是影響黃芪黃酮合成與積累的重要因素，高基質(zhì)濕度不利于黃芪黃酮類物質(zhì)的合成與積累且很可能與根中高LOX活性有關(guān)，低基質(zhì)濕度下較為穩(wěn)定的根際微生物群落很可能是黃芪幼苗中黃酮類物質(zhì)的合成與積累的有益因素。

黃芪；基質(zhì)濕度；綠葉揮發(fā)物；異黃酮；根際微生物

黃芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge]為常見補(bǔ)益類中藥，在抗腫瘤、抗疲勞、增強(qiáng)免疫等方面有著廣泛的臨床應(yīng)用。黃芪的品質(zhì)源于其內(nèi)在含有的皂苷類、黃酮類、多糖類等有效成分以及相互之間的綜合作用[1-4]，而上述有效成分的積累與黃芪藥材的生長環(huán)境有著密切的聯(lián)系。

近年來針對環(huán)境因素對于黃芪品質(zhì)的影響以及對黃芪有效成分調(diào)控機(jī)制的研究已有不少研究報(bào)道[5-9]，其中涉及黃酮類成分較多，但土壤水分對黃芪品質(zhì)形成及其根際微生物的影響，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。由于黃芪藥材中C6揮發(fā)物與其品質(zhì)相關(guān)，所以在研究藥材品質(zhì)形成中，除考慮活性物質(zhì)的合成和積累外，還應(yīng)考慮該類揮發(fā)物的作用[4,10]。

本研究即通過控制盆栽黃芪基質(zhì)濕度，模擬黃芪生境中不同的土壤水分，研究土壤水分對黃芪幼苗綠葉揮發(fā)物合成途徑關(guān)鍵酶—脂肪氧合酶(lipoxygenase, LOX)和苯丙烷合成途徑關(guān)鍵酶—苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin ammonia-lyase, PAL)活性、總黃酮含量和根際微生物的影響，以了解土壤水分在黃芪藥材品質(zhì)形成中的可能作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黃芪種子采集于山西渾源黃芪GAP基地，基源為蒙古黃芪(Astragalusmembranaceusvar.mongholicus)。暗培養(yǎng)箱中25℃萌發(fā)種子，萌發(fā)后移栽于不同基質(zhì)濕度的營養(yǎng)缽中，光照培養(yǎng)8周，明暗周期為14h/10h，對應(yīng)溫度為20℃/16℃。每組3個(gè)平行，每個(gè)平行5株植物。2周噴施液體肥料1次，間隔周噴以相同體積的自來水。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格控制噴施量，以保證基質(zhì)水分恒定。

盆栽培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，收集黃芪幼苗根、莖、葉和根際與非根際基質(zhì)，植物材料液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆?，根際土樣4℃保存，1周內(nèi)完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 基質(zhì)水分測定

參照《中華人民共和國藥典》(2010版)方法測定。1.3 根際微生物計(jì)數(shù)

采用梯度稀釋法，取適量稀釋液接種于LB和馬丁氏瓊脂平板中，前者于37℃培養(yǎng)48h，后者于28℃培養(yǎng)72h，進(jìn)行計(jì)數(shù)。每組樣品測定3個(gè)樣本，記錄CFU數(shù)量。

1.4 LOX與PAL活性測定

參照謝道生等、趙則海等方法制備粗酶提取液，并進(jìn)行酶活性測定[10-11]。

1.5 黃芪總黃酮的含量測定

參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

每組數(shù)據(jù)均為3個(gè)平行的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，SPSS 16.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 基質(zhì)濕度對黃芪幼苗根際微生物菌落的影響

以黃芪幼苗生長前基質(zhì)為對照，對實(shí)驗(yàn)結(jié)束后基質(zhì)水分含量和根際微生物數(shù)量進(jìn)行了計(jì)數(shù)，結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)分為高濕度組和低濕度組，其中低濕度組水分含量與對照間無顯著差異，而高濕度組明顯高于二者。細(xì)菌和真菌數(shù)量與水分含量變化特征一致，低濕度組根際細(xì)菌、真菌數(shù)量與對照間無顯著差異，高濕度組根際細(xì)菌和真菌數(shù)量明顯減少。簡言之，高基質(zhì)濕度是影響黃芪根際微生物菌群數(shù)量的重要環(huán)境因子之一。

表1 基質(zhì)濕度對黃芪幼苗根際微生物數(shù)量的影響

注：不同的字母表示組間存在顯著性差異，P<0.05；表2～4同。

2.2 基質(zhì)濕度對黃芪幼苗LOX的影響

黃芪幼苗根、莖、葉LOX活性測定結(jié)果見表2。從該表可以看出，基質(zhì)濕度對黃芪幼苗LOX活性的影響主要體現(xiàn)在葉片和根，對莖影響較小，高濕度與低濕度組莖LOX無顯著差異。在葉片中，高基質(zhì)濕度導(dǎo)致LOX活性顯著降低。而在根中，基質(zhì)高水分含量引起根LOX活性的顯著升高。該結(jié)果表明，黃芪幼苗地上和地下部分對土壤水分的響應(yīng)存在明顯差異。相同濕度組黃芪幼苗不同部位LOX活性的t-檢驗(yàn)結(jié)果表明，高濕度組幼苗不同部位LOX活性無顯著差異，而低濕度組莖葉間存在顯著差異。換言之，土壤水分含量低時(shí)，黃芪莖葉C6揮發(fā)物合成響應(yīng)存在差異，葉片C6揮發(fā)物合成途徑關(guān)鍵酶LOX活性顯著增加。

表2 基質(zhì)濕度對黃芪幼苗

2.3 基質(zhì)濕度對黃芪幼苗PAL活性的影響

已有研究表明，苯丙氨酸解氨酶(PAL)是黃芪黃酮類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，在該類物質(zhì)合成與積累中起著關(guān)鍵作用[12]。黃芪幼苗不同部位PAL測定結(jié)果見表4。從該表可以看出，PAL在黃芪幼苗根和莖中較為穩(wěn)定，2組數(shù)據(jù)間無顯著差異。但是，PAL活性在葉片組織中明顯不同，基質(zhì)高濕度導(dǎo)致葉片PAL活性顯著升高，即由基質(zhì)濕度引起的黃芪幼苗苯丙烷代謝途徑主要響應(yīng)部位為葉片，明顯有別于GLVs合成途徑的主要響應(yīng)部位。具體而言，高濕度基質(zhì)有助于黃芪葉片PAL活性升高。不同部位間PAL活性t-檢驗(yàn)結(jié)果表明，高濕度組莖葉PAL活性無顯著差異，但二者與根存在顯著差異。低濕度組中，根、莖、葉三者間PAL活性均存在顯著差異，特別是葉與莖、根之間差異極顯著，莖葉組織中活性遠(yuǎn)高于根。換言之，無論基質(zhì)濕度高低，黃芪幼苗中的主要響應(yīng)部位均為地上莖葉，特別是葉片，響應(yīng)最高。

表3 基質(zhì)濕度對黃芪幼苗不同部位

2.4 基質(zhì)濕度對黃芪幼苗總黃酮積累的影響

從表4可見，基質(zhì)濕度對黃芪幼苗莖葉總黃酮含量影響較小，高、低濕度組間莖葉含量均無顯著差異。但是，基質(zhì)濕度顯著影響著根中總黃酮含量，低基質(zhì)濕度組總黃酮含量顯著高于低濕度組，即低基質(zhì)濕度有利于黃酮類物質(zhì)在根中的積累。相同濕度組內(nèi)不同部位t-檢驗(yàn)結(jié)果表明，高濕度組黃芪幼苗葉與莖、葉與根之間存在顯著差異，與PAL活性分析結(jié)果正好相反。

表4 基質(zhì)濕度對黃芪幼苗

綜上所述，基質(zhì)濕度影響著黃芪防御應(yīng)答。較低的基質(zhì)濕度對黃芪黃酮合成的關(guān)鍵酶PAL活性和總黃酮積累影響更大，且響應(yīng)部位主要為根。

3 討論

趙則海等通過比較攀援型和矮生型四棱豆苯丙氨酸解氨酶活性和黃酮含量發(fā)現(xiàn)，PAL活性均為種子最高，嫩豆莢最低；總黃酮含量均為葉最高，儲藏器官塊根最低[13]。黃檗(PhellodendronamurenseRupr.)是我國名貴中藥關(guān)黃柏的藥源植物，黃檗生物堿是其主要藥效成分。李霞等發(fā)現(xiàn)，輕度干旱有利于黃檗根莖外皮中生物堿的合成與積累，水澇處理則導(dǎo)致幼苗生物堿的含量顯著降低[14]。在抗旱性不同的甘蔗中，10%聚乙二醇脅迫2h～14h，幼苗葉片中PAL活性均呈現(xiàn)先降低后升高的變化規(guī)律，但類黃酮含量在抗旱性強(qiáng)的品種中降低，而在抗旱性弱的品種中先降低后升高[15]。本研究中，無論是低濕度條件下生長的黃芪幼苗、還是高濕度條件下的黃芪幼苗，葉片中總黃酮含量均較高，但低基質(zhì)濕度促進(jìn)了藥用部位根中黃酮類物質(zhì)的積累。但PAL活性變化與總黃酮積累并不一致，在高濕度組幼苗葉片中活性最高。

在本研究中，高基質(zhì)濕度導(dǎo)致黃芪幼苗根際可培養(yǎng)微生物數(shù)量減少，即引起根際菌群的明顯改變，同時(shí)伴隨著根LOX活性的顯著增加。同時(shí)，低濕度組菌群可培養(yǎng)微生物數(shù)量與對照間無顯著差異，并伴隨著總黃酮積累的增加。該結(jié)果是不是意味著土壤水分在維系黃芪根際微生物平衡中發(fā)揮著重要作用，穩(wěn)定的根際微生態(tài)在藥材品質(zhì)形成中發(fā)揮著重要作用。為了解釋該問題，我們有必要從環(huán)境因子影響根際微生物與植物互作的角度，從多個(gè)層次研究藥用植物黃芪中黃酮類物質(zhì)積累機(jī)制。

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Effects of Matrix Moisture on Defense Response and Rhizosphere Microbial Communities ofAstragalusmembranaceusvar.mongholicusSeedlings

Xin Xiaojuan，Sun Haifeng，Li Yucheng，Cong Jianhua

(Forest Group Company of Agroforestry Sciences Academy of Daxing anling,Jiagedaqi,Heilongjiang 165000)

To find out potential role of soil water on quality formation of Astragali Radix by exploring effects of matrix moisture on defense response and rhizosphere microbial communities ofAstragalusmembranaceusvar.monghoseedlings. The matrix moisture was controlled by the method of root-sphere osmotic irrigation, isoflavone content and activities of lipoxygenase (LOX) and phenylalanin ammonia-lyase (PAL) involved in the biosynthese of green leaf volatiles (GLVs) and isoflavones respectively, were determined by spectrophotometry; colony forming units (CFU) of rhizosphere bacteria and fungi were counted by gradient dilution method, resulting data was analyzed by SPSS software. Results: Higher matrix moisture (81.6%) not only resulted in significant decrease in both rhizosphere bacterial and fungal CFUs and significant increase in leaf PAL and root LOX activities but lead to lower isoflavone content in roots. Comparatively, lower matrix moisture resulted in higher leaf LOX activities and relatively steady rhizosphere microbial communities and their CFUs were at the same level to the ones before planting. Matrix moisture affected the biosynthesis and accumulation of isoflavone compounds, and higher moisture adverse to the process, which might be caused by higher root LOX activity. Steady rhizosphere microbial communities in lower moisture level might benefit to the biosynthesis and accumulation of isoflavones.

Astragalusmembranaceusvar.mongholicusSeedlings; Matrix moisture; Green leaf volatiles; Isoflavone; Rhizosphere microbiota

2016-10-28

信小娟(1967-)，女，高級工程師，從事中草藥種植研究，E-mail:Xinxiaojuan323@163.com； *通訊作者：孫海峰，副教授，從事中藥質(zhì)量評價(jià)與品質(zhì)形成研究, E-mail:haifeng@sxu.edu.cn。

S567.23

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.01.003