（北京工商大學(xué)北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京100048）

傳統(tǒng)藏靈菇發(fā)酵乳揮發(fā)性風(fēng)味特征研究

郭婷，郝一江，張健，楊貞耐

（北京工商大學(xué)北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京100048）

采用固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-massspectrometry，GC-MS）檢測(cè)了采集自西藏和新疆的6個(gè)藏靈菇樣品作為發(fā)酵劑制備的發(fā)酵乳的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，共檢出揮發(fā)性風(fēng)味化合物36種，其中有機(jī)酸12種，酮類4種，醇類8種，醛類1種，酯類4種，烯烴類1種，烷烴類2種，其他化合物4種。主成分分析顯示酸、醇類是Kef3、Kef2和Kef6發(fā)酵乳樣品的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，乙酸和2-壬酮是Kef5樣品區(qū)別于其他樣品的特異性風(fēng)味物質(zhì)，Kef1樣品中的二叔丁基對(duì)甲酚、異戊醇和2-乙基己醇以及Kef4樣品中的苯甲酸、己酸乙酯和十四烷質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于其他樣品。樣品間的聚類和熱圖分析顯示，來(lái)源于新疆地區(qū)的3組樣品具有相似的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)，各組樣品中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高、種類較多的揮發(fā)性有機(jī)酸和醇類化合物構(gòu)成了傳統(tǒng)藏靈菇發(fā)酵乳獨(dú)有的特征風(fēng)味。

藏靈菇發(fā)酵乳；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)；固相微萃取(SPME)

0 引言

藏靈菇是我國(guó)牧區(qū)常用的乳品發(fā)酵劑，其發(fā)酵乳具有調(diào)節(jié)血壓和血脂等多種保健功能，是潛在功能性乳品發(fā)酵劑來(lái)源[1]，工業(yè)生產(chǎn)性能受到了廣泛關(guān)注。

風(fēng)味是評(píng)價(jià)乳品發(fā)酵劑生產(chǎn)性能的重要指標(biāo)，是影響消費(fèi)者選擇的首要因素[2]。發(fā)酵劑的選擇決定產(chǎn)品的風(fēng)味特性，因此不同發(fā)酵乳風(fēng)味特性一直是乳品研究的熱點(diǎn)[3]。目前普通酸奶發(fā)酵劑[4]、益生菌發(fā)酵劑[5,6]、嗜溫型發(fā)酵劑、嗜熱型發(fā)酵劑[7]和輔助發(fā)酵劑[8]的主要風(fēng)味物質(zhì)研究取得了較好的進(jìn)展[9]，并初步揭示了主要菌株發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)形成的機(jī)制[10]。但對(duì)于藏靈菇發(fā)酵劑的風(fēng)味特性報(bào)道較少，限制了該類發(fā)酵劑工業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用。

藏靈菇是酵母、乳酸菌、醋酸菌等形成的一個(gè)多樣的微生物共生體系[11]，其發(fā)酵乳具有獨(dú)特的酸味和香味[12]。本文研究藏靈菇發(fā)酵乳的風(fēng)味特征及不同地區(qū)藏靈菇發(fā)酵乳風(fēng)味間的差異，為明確傳統(tǒng)藏靈菇發(fā)酵乳的風(fēng)味特征及其形成機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

藏靈菇（Kef1、Kef2、Kef3采集于新疆牧區(qū)，Kef4、Kef5、Kef6采集于西藏牧區(qū)）；牛乳。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（PL203），手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器（DVB-CAR-PDMS），氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。

1.3 藏靈菇發(fā)酵乳樣品的制備

取低溫保存的藏靈菇0.5 g接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11%的250 mL經(jīng)殺菌處理（115℃，15 min）的牛乳培養(yǎng)基中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)活化20 h后，用無(wú)菌生理鹽水將藏靈菇?jīng)_洗干凈，稱取0.25 g接種至200 mL已滅菌的牛乳中，25℃發(fā)酵20 h。

1.4 頂空固相微萃取發(fā)酵乳樣品

準(zhǔn)確量取10 mL發(fā)酵乳樣品，加入1 g飽和NaC l溶液于萃取小瓶，放置于45℃水浴中并保持30 min,然后將已老化好的萃取頭插入到萃取瓶中進(jìn)行萃取，富集風(fēng)味物質(zhì)30 min后取出纖維頭，然后將其插入GC-MS進(jìn)樣口解吸5 min，拔出萃取頭進(jìn)行GC-MS分析。

1.5 GC-MS分析

色譜柱：DB-WAX毛細(xì)管柱（30m×250μm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為250℃。

升溫程序：初始溫度，40℃，保持2.5 min，以5℃/ min升溫到200℃，再以10℃/ min升溫到230℃，保持5 min。載氣(He)，恒定流速為3 mL/ min，進(jìn)樣口溫度250℃，不分流。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（electron i mpact，EI）離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280℃，離子源溫度為230℃，四極桿溫度為150℃,質(zhì)量掃描范圍30～400 m/z。

1.6 數(shù)據(jù)分析

揮發(fā)性成分分析：運(yùn)用N IST14譜庫(kù)檢索，保留匹配度大于或等于800的成分；通過(guò)計(jì)算保留指數(shù)結(jié)合文獻(xiàn)保留指數(shù)進(jìn)一步對(duì)化合物進(jìn)行定性。化合物定量：按峰面積歸一化法計(jì)算相對(duì)量。數(shù)據(jù)分析：每個(gè)樣品均設(shè)3次重復(fù)，數(shù)據(jù)以均值±方差表示，采用SPSS12.0軟件進(jìn)行方差分析，P＞0.05表示差異不顯著，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏靈菇發(fā)酵乳GC-MS檢測(cè)結(jié)果

6種藏靈菇發(fā)酵乳的揮發(fā)性風(fēng)味化合物的分析結(jié)果如表1所示。共檢測(cè)出揮發(fā)性風(fēng)味化合物36種，其中有機(jī)酸12種，酮類4種，醇類8種，醛類1種，酯類4種，烯烴類1種，烷烴類2種，其它化合物4種。Kef1發(fā)酵乳樣品含有20種揮發(fā)性化合物，其中有機(jī)酸9種，醇類5種，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別占揮發(fā)性化合物總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的36.52%和34.88%；Kef2發(fā)酵乳樣品含有34種揮發(fā)性風(fēng)味化合物,其中有機(jī)酸12種，醇類8種，酮類4種，酯類4種，有機(jī)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（51.58%）高于Kef1樣品，醇類質(zhì)量分?jǐn)?shù)（27.22%）低于Kef1樣品；Kef3發(fā)酵乳樣品含有31種揮發(fā)性風(fēng)味化合物,其中有機(jī)酸12種，醇類6種，酮類4種，酯類4種，以有機(jī)酸（59.17%）和醇類（24.46%）為主；Kef4發(fā)酵乳樣品含有27種揮發(fā)性風(fēng)味化合物,其中有機(jī)酸9種，醇類6種，酮類2種，酯類4種，以有機(jī)酸（43.87%）為主,其酯類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（12.99%）高于其他樣品；Kef5發(fā)酵乳樣品含有30種揮發(fā)性風(fēng)味化合物,其中有機(jī)酸10種，醇類8種，酮類4種，酯類3種，以有機(jī)酸（50.56%）和醇類（23.47%）為主；Kef6發(fā)酵乳樣品含有33種揮發(fā)性風(fēng)味化合物,其中有機(jī)酸11種，醇類8種，酮類4種，酯類4種，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多的是有機(jī)酸（50.19%）。藏靈菇發(fā)酵乳改變了牛乳中所含酸、醇、酯等物質(zhì)種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)，形成了復(fù)雜多樣的風(fēng)味和滋味體系[13]。

（1）酸類化合物。揮發(fā)性有機(jī)酸主要由乳中脂肪在脂肪酶的作用下水解形成[14]，有顯著的特征氣味，是發(fā)酵乳清爽口感和乳香味的主要來(lái)源。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到藏靈菇發(fā)酵乳酸類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36.52%～60.19%，乙酸、丁酸、己酸和辛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，后三者也是牛乳本底風(fēng)味脂肪酸[15]，發(fā)酵后質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，這與葛武鵬等的酸奶檢測(cè)結(jié)果一致[16]。乙酸賦予發(fā)酵乳淡淡的酸味；丁酸具有多汁味、奶油味；己酸具有油脂味[14]；辛酸具有清香和微弱的水果酸氣味，淡酸味[17]。另外，這些脂肪酸還具有抗病毒、抗腫瘤、降膽固醇等生物活性，也是發(fā)酵乳中的重要功能組分[18]。

（2）醇類化合物。本研究檢測(cè)顯示各樣品中醇類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.37%～34.88%。乙醇由藏靈菇中的酵母無(wú)氧代謝產(chǎn)生，其它高分子醇類大部分來(lái)自脂肪氧化，由脂肪酶降解乳中的脂肪酸產(chǎn)生[19]。大分子醇類通常具有芳香、植物香、酸敗和土氣味，但閾值較高，對(duì)發(fā)酵乳整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)較小[20]。

（3）酮類化合物。發(fā)酵乳中酮類多為不飽和脂肪酸的氧化、熱降解和氨基酸降解產(chǎn)物[21]。樣品中酮類質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.43%～7.21%,該類化合物閾值低，可以賦予發(fā)酵乳典型的風(fēng)味[22]。丁二酮被認(rèn)為是酸奶風(fēng)味形成的最主要部分。檢測(cè)顯示藏靈菇發(fā)酵乳中揮發(fā)性酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較少，共發(fā)現(xiàn)4種，比劉南南等[23]報(bào)道的酸奶中揮發(fā)性酮種類少。2-庚酮由亞油酸氧化產(chǎn)生，有奶油氣味，是酸奶風(fēng)味物質(zhì)中的主要成分；2-壬酮呈果香、甜香、青香及椰子、奶油的氣味；2-十一酮具有蠟香、脂肪香，并帶有奶油、乳酪的味道[14]。

（4）醛類化合物。醛類化合物的化學(xué)性質(zhì)比較活潑，屬于不穩(wěn)定的中間體化合物，在一定條件下易被還原成相應(yīng)的醇，因此通常而言這類化合物在發(fā)酵乳中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都不高。盡管如此，由于這類化合物風(fēng)味閾值較低，因而仍是酸奶風(fēng)味中不可缺少的部分。本研究6個(gè)樣品中均檢出苯甲醛，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.37%～ 3.99%。據(jù)報(bào)道苯甲醛具有苦杏仁、櫻桃及堅(jiān)果香氣[14]。

（5）酯類化合物。本研究共檢出4種酯類化合物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2.03%～12.99%。有3種乙酯類化合物，它們是由乙醇和牛乳中的脂肪酸反應(yīng)產(chǎn)生。己酸乙酯具有強(qiáng)烈的甜的果香、菠蘿、香蕉香氣，有花香底調(diào)，擴(kuò)散力強(qiáng)，香力持久性一般；葵酸乙酯具有近似于葡萄的香氣[14]。

（6）其他化合物。本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)到少量的酚類和硫化物，二甲基二硫是牛奶中的本底風(fēng)味物質(zhì)，由β-乳球蛋白和脂肪球膜經(jīng)光照后產(chǎn)生[24]。二叔丁基苯酚和二叔丁基對(duì)甲酚是食品抗氧化劑，在白酒的揮發(fā)性物質(zhì)中有檢出，推測(cè)由酵母細(xì)胞自溶后釋放[25]。

表1 藏靈菇發(fā)酵乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

2.2 藏靈菇發(fā)酵乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主成分分析

不同來(lái)源藏靈菇發(fā)酵乳的風(fēng)味物質(zhì)種類質(zhì)量分?jǐn)?shù)上均有較大差異。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類檢出最少的Kef1有20種，最多的Kef2有34種。質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異最大的乙酸在樣品Kef6和Kef4中檢出量為0，而Kef5樣品中乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)30.43%。這使得不同來(lái)源藏靈菇的發(fā)酵乳表現(xiàn)出不同的風(fēng)味趨向。為明確不同種類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對(duì)藏靈菇發(fā)酵乳風(fēng)味的影響，利用主成分分析法考察了揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與樣品間的分布關(guān)系，結(jié)果如圖1所示。

圖1 6種藏靈菇發(fā)酵乳和33種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在第一和第二主成分上的分布散點(diǎn)圖

圖1中，f1和f2主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為62.39%，風(fēng)味物質(zhì)中酸和醇對(duì)f1貢獻(xiàn)率分別為43.49%和19.33%，對(duì)f2貢獻(xiàn)率分別為32.33%和22.52%，另外酯、酮風(fēng)味物質(zhì)對(duì)f2貢獻(xiàn)率分別為11.94%和9.75%，醛風(fēng)味物質(zhì)對(duì)f1貢獻(xiàn)率為6.06%，其他風(fēng)味物質(zhì)貢獻(xiàn)率較低。樣品Kef2，Kef3和Kef6沿第一主成分（f1）正向（>0）分布，在主成分f2方向投影較短，這表明酸、醇類揮發(fā)性物質(zhì)的種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)占有較大的比重，可能會(huì)對(duì)風(fēng)味產(chǎn)生明顯影響。Kef5和Kef1分布在f1負(fù)方向，較為分散，Kef4是在f2主成分方向投影與其在f1主成分方向投影相接近的樣品，說(shuō)明除了酸和醇類外，其它種類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)可能對(duì)其影響較大，具體如圖1所示，在Kef4射線附近分布的苯甲酸（9）、己酸乙酯（27）和十四烷（31）在Kef4樣品中的檢出量均顯著高于其它樣品（P<0.05）。類似的Kef5樣品中乙酸（1）和2-壬酮（22）質(zhì)量分?jǐn)?shù)，Kef1樣品中的二叔丁基苯酚（35）、異戊醇（14）和2-乙基己醇（17）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于其它樣品（P<0.05）。這些揮發(fā)性物質(zhì)種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)間的差異造成了藏靈菇發(fā)酵乳樣品風(fēng)味的不同。

2.3 藏靈菇發(fā)酵乳樣品的聚類分析

為了進(jìn)一步明確不同來(lái)源藏靈菇發(fā)酵乳樣品間揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定量性差異，實(shí)驗(yàn)對(duì)6組樣品進(jìn)行了聚類分析并繪制了樣品中揮發(fā)性物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的熱圖。由圖2可以看出，Kef1、Kef2、Kef3可以很好地聚為一類，而Kef4、Kef5、Kef6則各成一類，這說(shuō)明通過(guò)風(fēng)味成分的聚類分析，可以基本反映不同藏靈菇發(fā)酵乳樣品的風(fēng)味特征。結(jié)果顯示來(lái)源于新疆地區(qū)的2組樣品Kef2和Kef3風(fēng)味的種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)更為接近，這一類主要聚集了酸類和醇類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，酮類、醛類、酯類質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低的品種。采集自西藏的2組樣品Kef4、Kef5分類距離較近，酸類和醇類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，酮類、醛類、酯類質(zhì)量分?jǐn)?shù)次之，對(duì)藏靈菇發(fā)酵乳風(fēng)味也具有一定貢獻(xiàn)。樣品Kef6與其它樣品間差異較大。由圖2可知藏靈菇發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)涵蓋了酸、醇、酮、醛、酯，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的是酸類和醇類風(fēng)味物質(zhì)。

3 結(jié)論

采用固相微萃取、GC-MS和主成分分析法，對(duì)采集自西藏和新疆的6個(gè)藏靈菇樣品制備的發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)了36種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，確定了主要的揮發(fā)性組分為酸類（36.52%～ 60.19%）、醇類（5.37%～34.88%）、酮類（3.43%～7.21%）、醛類（0.37%～3.99%）、酯類（2.03%～12.99%）及其他化合物。

圖2 樣品風(fēng)味物質(zhì)的熱圖和聚類分析

研究還發(fā)現(xiàn)，藏靈菇樣品間揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在較大差異，聚類分析的結(jié)果顯示來(lái)源于新疆地區(qū)的3組樣品間風(fēng)味的種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)更為接近，采集自西藏的2組樣品分類距離較近，樣品Kef6與其它樣品間差異較大，產(chǎn)生差異的具體原因，需在明確藏靈菇微生物多樣性和豐度差異及其中微生物個(gè)體和群體間的風(fēng)味物質(zhì)代謝圖譜的基礎(chǔ)上進(jìn)一步解析。

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Research on volatile flavor characteristicsof yogurt fer mented by traditional Kefir

GUO Ting,HAO Yijiang,ZHANG Jian,YANG Zhennai
(Beijing Advanced Innovation Cen ter for Food N u trition and H u man H ealth,Beijing Technology and Business Univisty, Beijing 100048,China)

Solid phase microextraction(SPME)and gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)were used to analyze volatile com?pounds in fermented milk prepared by 6 Kefir samples collected fro mdifferent regionsof Tibet and Sinkiang.A total of 36 volatile flavor co mpoundsw ere identified in the 6 yogurt sa mples fermented by traditional Kefir,including 12 acids,4 ketones,8 alcohols,1 aldehyde,4 es?ters,1 olkens,2 hydrocarbonsand 4 other co mpounds.The resultsof principal co mponent analysis(PCA)show ed that organic acidsand alco?holsw ere themajor volatile co mponents in the sa mples Kef3、Kef2 and Kef6.For sa mple Kef5,acetic acid and 2-nonanone w ere the specific flavor co mpounds.The contentsof butylatedhydroxytoluene、3-methyl-1-butanol、2-ethyl-1-hexanol in Kef1 and benzoic acid、hexanoic acid,ethyl ester and tetradecane in Kef4 w ere significantly higher than other sa mples.The results of cluster analysis show ed that there were si milar contentsand kindsof compondsin the3 samples fro mSinkiang.In all these samples,the organic acidsand alcohol compoundsw ith rel?atively higher contentconstitute the unique flavor characteristicsof the traditionalKefir fermented milk.

yogurt fermented by traditional Kefir；volatile flavor components；gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)；solid phase microextraction(SPME)

TS252.1

A

1001-2230（2017）01-0008-04

2016-06-23

郭婷(1992-)，女，碩士研究生，從事乳制品方面的研究。

楊貞耐