徐 悅,徐 海,鮑 熹,王義偉,盧 宇,侯繼波

(1.江蘇省農業(yè)科學院 國家獸用生物制品工程技術研究中心,江蘇 南京 210014;2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚州 225009)

T7噬菌體p10融合蛋白表達及自組裝VLP觀察

徐 悅1，2,徐 海1，2,鮑 熹1，2,王義偉1，2,盧 宇1，2,侯繼波1,2

(1.江蘇省農業(yè)科學院 國家獸用生物制品工程技術研究中心,江蘇 南京 210014;2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚州 225009)

原核表達T7噬菌體p10融合蛋白, PCR擴增p10基因并在基因下游連接口蹄疫病毒(FMDV)VP1抗原表位基因；將融合基因插入pET-28a載體,構建重組質粒；用IPTG誘導重組菌表達目標蛋白,通過電鏡觀察病毒樣顆粒(VLP)的形成。結果成功構建了pET-p10-VP1表達菌株。SDS-PAGE、Western-blot檢測顯示目標蛋白高效表達并與VP1特異性抗體產生免疫反應。回收p10-VP1蛋白樣品經透射電鏡觀察,有40 nm VLP生成。表明T7噬菌體p10蛋白具有良好的VLP自組裝功能,并可用于抗原表位的表面展示。

T7噬菌體;口蹄疫;表達; VLP

口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus, FMDV)引起的偶蹄獸急性高度接觸性傳染病,對動物及人類健康都構成了嚴重的威脅,給發(fā)病國家和地區(qū)帶來了重大的經濟損失[1]。FMDV為單股正鏈RNA病毒,共分為7個血清型,在我國境內暴發(fā)的疫情以O、A型為主[2]。FMDV包含4個結構蛋白,其中VP1是主要保護性抗原[3]?？谔阋吆铣呻囊呙缋肰P1[120～160]位抗原表位能夠激發(fā)抗感染免疫,成為一種更安全高效的新型疫苗[4]。但由于該抗原表位是一段40個氨基酸的抗原決定簇,自身免疫原性弱,需要偶聯(lián)大分子的半抗原載體來增加免疫原性[5-6],例如血藍蛋白、牛血清白蛋白、IgG重鏈等。如果能將抗原表位與載體蛋白融合表達并形成病毒樣顆粒(virus-like particles, VLP)的結構,則展示在顆粒表面的抗原表位就能很好地被免疫細胞識別與遞呈,從而提高免疫效力[7]。

T7噬菌體是一種侵染大腸桿菌的烈性噬菌體,其基因組為線性雙鏈DNA,全長39 kb[8]。T7噬菌體頭部由gp8、9、10、14、15、16六種蛋白裝配而成,其中支架蛋白(gp9)、主要衣殼蛋白(gp10)在裝配中起主要作用。當T7噬菌體完成基因復制與蛋白翻譯后,gp9、gp10首先裝配成一個無DNA、無尾的前衣殼,其形態(tài)比成熟噬菌體粒子顯得圓且小[9]。據(jù)Cerritelli等報道，單獨表達gp9、gp10蛋白并按比例混合反應可以組裝出噬菌體前衣殼[10]。衣殼蛋白gp10由主要頭部蛋白p10A和次要頭部蛋白p10B組成,gp10正常翻譯生成344個氨基酸的p10A,但在341位氨基酸處閱讀框漂移通讀后生成397個氨基酸的p10B,在野生型T7噬菌體中p10B約占總衣殼蛋白的10%。改造去除漂移位點,并在其后融合表達外源多肽,可使其展示在衣殼蛋白的表面。噬菌體衣殼蛋白自組裝成顆粒樣結構的能力在VLP研究中得到了廣泛應用。

本研究嘗試表達gp10與口蹄疫VP1[120～160]融合蛋白,通過電鏡觀察該蛋白自我組裝成VLP的能力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

質粒和菌株: pMD19-T克隆載體購于TAKARA公司；原核表達載體pET-28a(+)由本實驗室保存；宿主菌DH5α、BL21(DE3)購于諾唯贊公司。

主要試劑:限制性核酸內切酶、Taq酶購自TaKaRa公司; T7 Tag-HRP抗體購自默克公司; DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質粒小量制備試劑盒皆購于上海捷瑞生物工程有限公司;其他所需試劑均為分析純;色譜柱填料Sephadex G-50購自Amersham Bioseienee公司。

主要儀器: TDZ5-WS水平離心機; AIRTECH超凈工作臺;隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱為上海躍進醫(yī)療器械廠產品; PCR儀購自TAKARA公司;超聲破碎儀購自寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 pET-p10-VP1質粒的構建驗證

通過SOE-PCR方法將T7噬菌體p10基因和FMDV VP1(120～160)基因片段連接起來,擴增產物經膠回收試劑盒進行回收純化,并與pMD19-T連接,轉化至感受態(tài)細胞DH5α中,抽提質粒，進行雙酶切驗證并測序。將p10-VP1基因片段插入至pET-28a的NcoⅠ和EcoRⅠ位點之間,轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,構建重組表達質粒pET-p10-VP1。

1.3 p10-VP1蛋白的誘導表達

誘導表達過程參照pET系統(tǒng)操作手冊,將含有pET-p10-VP1質粒的重組菌接種至含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至OD600≈0.8；加入IPTG至終濃度為1 mmol/mL,在25 ℃下誘導培養(yǎng)4 h；誘導結束后收集菌體,用PBS洗滌2遍,按1/2比例濃縮體積。超聲破碎菌體,離心收集沉淀和上清,使用PBS重懸沉淀至破碎前原體積,取樣進行SDS-PAGE電泳,檢測表達產物。

1.4 p10-VP1蛋白的Western-blot鑒定

將待檢蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳,然后轉印至硝酸纖維素膜。使用含有5%BSA的PBST于4 ℃封閉過夜;用PBST洗滌3遍,加入T7 Tag-HRP抗體在37 ℃下作用1 h,用PBST洗滌5遍,使用DAB顯色試劑盒顯色。

1.5 p10-VP1蛋白的純化

將蛋白樣品凍干后重新溶解,使用Sephadex G-50進行分離純化,洗脫液為Tris-HCI緩沖液(0.02 mol/L, pH 7.8)。分離條件:上樣質量濃度100 mg/mL,上樣量3 mL,流速為0.3 mL/min。每管收集3 mL,測定A280值,當A280小于0.05時停止洗脫。收集各峰組分進行凍干,溶解后通過SDS-PAGE電泳檢測得到的目的蛋白。

1.6 p10-VP1蛋白的電鏡觀察

將20 μL p10-VP1蛋白溶液置載樣銅網上,吸附1 min,用濾紙從側面吸去多余液體,滴加0.5%醋酸鉛溶液,在室溫下負染10 min；然后吸去多余負染液,于白熾燈下干燥10 min,在電子顯微鏡下觀察并照相。

2 結果與分析

2.1 表達質粒載體pET-p10-VP1的構建

以T7噬菌體基因組為模板,擴增p10基因,產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后,擴增片段大小與預期相符；純化回收目的片段,與pMD19-T連接后測序,測序結果與預期結果一致。將PCR產物和質粒pET-28a分別進行雙酶切,之后在37 ℃下連接,構建原核表達載體pET-p10-VP1,并將連接產物轉化至感受態(tài)細胞BL21(DE3);擴增培養(yǎng)重組菌并抽提質粒后,進行酶切驗證,得到的目的片段為1250 bp左右(圖1)。

Lane M: Marker; Lane 1～2:未酶切的pet28-p10-VP1質粒;

2.2 p10-VP1蛋白的表達與鑒定

將含有質粒pET-p10-VP1的大腸桿菌BL21(DE3)接種于LB培養(yǎng)基,經IPTG誘導、超聲破碎,取沉淀和上清進行檢測。SDS-PAGE電泳結果顯示,在相對分子質量為45000附近有明顯的蛋白帶,與預期蛋白大小相符(圖2)。由圖2可見,在25 ℃下表達蛋白在上清中條帶較深,而在沉淀中條帶不明顯,說明在該溫度下目的蛋白部分以可溶性蛋白的形式存在。

對表達蛋白進行Western-blot分析,結果(圖3)表明,重組表達產物能夠被特異性識別,在47 ku處有特異性蛋白條帶。

Lane M: Marker; Lane 1:未誘導的BL21(DE3)/pET-p10-VP1菌體; Lane 2:在25 ℃下用IPTG誘導的BL21(DE3)/pET-p10-VP1菌體上清; Lane 3:在25 ℃下用IPTG誘導的BL21(DE3)/pET-p10-VP1菌體沉淀。

圖2 BL21(DE3)/pET-p10-VP1表達產物的SDS-PAGE電泳結果

Lane M: Marker; Lane 1:未誘導的BL21(DE3)/pET-p10-VP1菌體; Lane 2:在25 ℃下用IPTG誘導的BL21(DE3)/pET-p10-VP1菌體上清; Lane 3:在25 ℃下用IPTG誘導的BL21(DE3)/pET-p10-VP1菌體沉淀。

圖3 BL21(DE3)/pET-p10-VP1表達蛋白的Western-blot分析結果

2.3 p10-VP1蛋白的純化

按照1.6中的方法對蛋白凍干樣品進行凝膠層析,在280 nm處測定波長,得到色譜圖(圖4)。收集各峰處溶液，將其凍干,溶解后通過SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)符合目的蛋白分子量的條帶主要存在于峰Ⅰ(圖5)。

圖4 BL21(DE3)/pET-p10-VP1表達蛋白經Sephadex G-50分子篩凝膠層析

Lane M: Marker; Lane 1～6: BL21(DE3)/pET-p10-VP1表達產物經Sephadex G-50分子篩凝膠層析后峰Ⅰ中58～62管。

圖5 BL21(DE3)/pET-p10-VP1表達蛋白經Sephadex G-50分子篩凝膠層析后的SDS-PAGE電泳結果

2.4 p10-VP1蛋白的電鏡觀察

將峰Ⅰ中收集蛋白置于電鏡下觀察，可見經過純化的p10B-VP1融合蛋白能夠聚集形成形狀不規(guī)則的完整VLP粒子,直徑在20～40 nm(圖6)。該結果與預期相符合。

3 討論

T7噬菌體作為原核生物的病毒,在感染BL21后可以利用細菌蛋白元件啟動自身蛋白的表達[11]。本研究將p10蛋白基因克隆至pET-28表達載體并導入BL21-DE3進行誘導表達,其蛋白表達過程與噬菌體自然感染啟動表達相類似,這不僅能夠保證較高的蛋白表達量,其相同的表達環(huán)境還便于p10蛋白的正確折疊，使其保持自然狀態(tài)。SDS-PAGE分析結果顯示,誘導表達的p10-VP1蛋白以可溶性表達為主。這為自組裝成VLP提供了依據(jù)。

抗原遞呈是啟動免疫應答的第一步,VP1中和性抗原表位因受其自身大小的限制不能引起足夠的免疫應答。為了用有效的遞呈抗原刺激機體，使之產生針對抗原的特定抗體,需要偶聯(lián)大分子載體蛋白[12]。VLP是由病毒衣殼蛋白裝配而成不含病毒核酸的空殼,具有病毒的結構和免疫原性,能夠誘導機體產生很強的免疫反應;由于其不攜帶遺傳信息,因此可以避免病毒感染風險，提高安全性。本研究選擇以E.coliBL21為單一宿主的T7噬菌體作為VLP研究對象,通過表達p10衣殼蛋白并利用其表面展示特性,嘗試自組裝VLP，一方面提高VLP使用的安全性,另一方面有效遞呈表面展示的抗原表位?？乖w粒的大小影響免疫應答的效率與類型[13]；20～200 nm的顆粒抗原不僅能夠直接進入淋巴管并快速轉運至B細胞聚集區(qū),還能進行有效的APC識別與遞呈。本研究選取的T7噬菌體頭部約50 nm,是理想大小的免疫原。

圖6 BL21(DE3)/pET-p10-VP1表達蛋白的透射電鏡形態(tài)

T7噬菌體頭部的組裝需要多個蛋白的協(xié)同,其中包括gene 8編碼的接頭蛋白、gene 9編碼的折疊蛋白、gene 10編碼的主要衣殼蛋白和次要衣殼蛋白。有文獻[14]報道T7噬菌體在缺失gene 9和gene 10的情況下不能形成衣殼；當缺失gene 8和一些內核蛋白如gene 14、15、16時不能夠形成衣殼,但能夠不規(guī)則地聚集形成多聚衣殼。本研究試圖驗證在單獨表達衣殼蛋白的情況下,是否能夠組裝成有顆粒結構的VLP粒子。電鏡觀察結果表明,經過純化的p10B-VP1融合蛋白能夠隨機聚集形成形狀不規(guī)則的完整粒子,其大小、形狀與T7噬菌體頭部有差異,但與文獻報道相符合,因此該方法可以用于VLP的制備。

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(責任編輯:黃榮華)

Expression of p10 Fusion Protein from Bacteriophage T7 and Observation of Self-assembled VLP

XU Yue1，2, XU Hai1，2, BAO Xi1，2, WANG Yi-wei1，2, LU Yu1，2, HOU Ji-bo1,2*

(1. National Research Center of Engineering and Technology for Veterinary Biological Products, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. Jiangsu Provincial Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

The prokaryotic expression of the fusion protein p10 from bacteriophage T7 was studied, and the formation of self-assembled virus-like particle (VLP) was observed under the electron microscope. The p10 gene was amplified through PCR, and it was linked to the VP1 antigenic epitope gene in foot and mouth disease virus (FMDV). The fusion gene in downstream was inserted into pET-28a vector to construct the recombinant plasmid, and IPTG was used to induce the recombinant bacteria expressing target protein. The VLP formation was observed by electron microscopy. The results showed that the pET-p10-VP1 expression strain was constructed successfully. SDS-PAGE and Western-blot analysis showed the target protein was high-efficiently expressed, and it generated an immune response to the VP1 specific antibody. A 40-nm VLP was produced in the recovered p10-VP1 protein samples observed by transmission electron microscopy. The above results suggested that the fusion protein p10 from bacteriophage T7 could self-assemble VLP and could be used for the surface display of antigenic epitope.

Bacteriophage T7; Foot and mouth disease virus; Expression; VLP

2016-09-06

江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目[CX(14)2085];公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201303046)。

徐悅(1986─),女,江蘇南京人,碩士研究生,研究方向為預防獸醫(yī)。*通訊作者:侯繼波。

Q78

A

1001-8581(2017)02-0014-04