黎 銘,何蘋萍,陳 明,李麗萍,王 瑞,黃 婷,陳福艷,馬春霞

(1.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院/廣西遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530021;2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所,廣西 南寧 530001)

利用釀酒酵母表達(dá)抗菌肽Lvcrunstin-B

黎 銘1,何蘋萍1,陳 明1,李麗萍1,王 瑞1,黃 婷1,陳福艷1,馬春霞2*

(1.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院/廣西遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530021;2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所,廣西 南寧 530001)

根據(jù)凡納濱對(duì)蝦抗菌肽Lvcrustin-B的核酸序列,采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成Lvcrustin-B基因,通過雙酶切及T4連接酶技術(shù)將Lvcrustin-B插入表達(dá)載體pYE-GAPα,獲得重組酵母表達(dá)載體pYE-GAPα-Lvcrustin-B。pYE-GAPα-Lvcrustin-B經(jīng)限制性內(nèi)切酶AVr II線性化后,通過電穿孔法轉(zhuǎn)化至畢赤酵母細(xì)胞GS115,并使用Zeocin進(jìn)行抗性篩選,從而獲得高拷貝轉(zhuǎn)化子,篩選出的酵母菌轉(zhuǎn)化子經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后使用YPD培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。PCR檢測(cè)結(jié)果表明Lvcrustin-B基因被穩(wěn)定整合至畢赤酵母染色體。SDS-PAGE電泳及WB實(shí)驗(yàn)顯示,目的重組蛋白Lvcrustin-B可在畢赤酵母中表達(dá),分子量大小為19.4 kD,且表達(dá)方式為可分泌性表達(dá),重組菌最佳培養(yǎng)溫度為30 ℃。

抗菌肽;凡納濱對(duì)蝦;GS115;蛋白表達(dá)

在我國(guó),水產(chǎn)養(yǎng)殖是一個(gè)重要的產(chǎn)業(yè),約束其可持續(xù)性發(fā)展的主要因素是病害問題:各種細(xì)菌或者病毒病經(jīng)常引起魚、蝦大量死亡,從而給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。為了預(yù)防和控制魚、蝦病害發(fā)生,養(yǎng)殖戶不得不大量使用池塘消毒化學(xué)藥物或者在飼料中添加各種抗生素藥物[3]。公眾越來越意識(shí)到:大量使用化學(xué)藥物或者抗生素類藥物會(huì)嚴(yán)重破壞環(huán)境生態(tài)以及帶來食品安全問題,因此,業(yè)內(nèi)亟待開發(fā)無污染、無殘留、安全有效的新型漁藥用以代替化學(xué)或者抗生素類藥物[4]。

抗菌肽(Antimicrobial peptides)又叫抗微生物多肽或肽抗生素,是生物細(xì)胞特定基因編碼并由特定外界條件誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類多肽[5]?？咕脑趧?dòng)、植物體內(nèi)分布廣泛,是天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分[5-6]。與抗生素比較,抗菌肽有以下特點(diǎn):可以抗革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌,對(duì)寄生蟲、真菌甚至病毒具有抵抗作用;分子量小,容易被吸收,殺菌作用迅速,不易產(chǎn)生耐藥性;抗菌濃度小,濃度單位一般在μmol/L級(jí)水平?？咕淖鳛閭鹘y(tǒng)抗生素的替代物正越來越受到人們的關(guān)注,是目前國(guó)際學(xué)術(shù)研究的活躍領(lǐng)域之一[7]。

抗菌肽作為飼料添加劑具有較好的應(yīng)用前景?？咕哪苣褪茱暳现屏r(shí)的高溫,特別是利用酵母表達(dá)的抗菌肽經(jīng)高溫濃縮工序,可充分殺滅酵母菌體而不導(dǎo)致抗菌肽失活,產(chǎn)品應(yīng)用后不出現(xiàn)工程菌擴(kuò)散而導(dǎo)致的環(huán)境生態(tài)問題[8]。部分抗菌肽具有抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的能力,使之不被胃腸道分解而進(jìn)入機(jī)體發(fā)揮作用[8]。

抗菌肽在甲殼類動(dòng)物飼料生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。與脊椎動(dòng)物不同,甲殼類動(dòng)物不產(chǎn)生特異性抗體,其抵御病原入侵主要依賴非特異性免疫系統(tǒng)。凡納濱對(duì)蝦的非特異性免疫系統(tǒng)重要組分在抵御病原入侵過程中扮演重要角色[9-10]。據(jù)報(bào)道,凡納濱對(duì)蝦基因組含有大量抗病免疫基因,比如凝集素、抗菌肽、溶菌酶、過氧化物酶等,這些基因有的已經(jīng)被應(yīng)用于魚蝦抗病藥物的開發(fā)[9-10]。

Lvcrustin-B是筆者在凡納濱對(duì)蝦中新發(fā)現(xiàn)的抗菌肽基因。本研究利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建該基因的真核表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化酵母菌進(jìn)行表達(dá),旨在為L(zhǎng)vcrustin-B的生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和耗材 pYE-GAPα質(zhì)粒及TOP10菌株(本實(shí)驗(yàn)室保種),GS115(Life公司),Protein Marker(北京全式金),PVDF膜(美國(guó)Millipore公司),X光片(美國(guó)柯達(dá)公司),ECL顯色液(中國(guó)普利萊公司),鼠抗His單抗(北京全式金),兔抗鼠HRP二抗(北京全式金),Acr、Bis、Tris等(Sigma公司),SDS(Amresco公司),Tryptone、Yeast Extract(購(gòu)自O(shè)XOID公司),PCR反應(yīng)管,0.22 μm無菌濾器和透析袋(購(gòu)自Millipore公司),Ni2+IDA親和層析膠(北京全式金公司),Agarose,DNA膠純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒(北京全式金公司),限制性內(nèi)切酶(大連寶生物公司),常規(guī)生化試劑(均為國(guó)產(chǎn)分析純)。

pYE-GAPα質(zhì)粒(見圖1)為環(huán)狀雙螺旋質(zhì)粒,空載質(zhì)粒含3080個(gè)堿基,含有1個(gè)博萊霉素篩選基因Zeocin,多克隆位點(diǎn)可以插入外源基因,多克隆位點(diǎn)上游含有6個(gè)組氨酸編碼序列,因此所表達(dá)的蛋白含有由6個(gè)組氨酸組成的蛋白標(biāo)簽。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 Allegra 21R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)BECKMAN公司),臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)SORVAL公司),Biologic LP層析系統(tǒng)、Mini Protean II垂直平板電泳系統(tǒng)、Gel Doc2000成像系統(tǒng)、水平電泳系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)，PTC-200基因擴(kuò)增儀(美國(guó)MJ Research公司)，320-S pH計(jì)(美國(guó)Mettler Toledo公司)，AR5120電子天平(美國(guó)AHOM S公司)，MultiTemp III恒溫水浴鍋、Hofer ΜV-25紫外透射儀(美國(guó)Amersham Pharmacia公司)，雪花狀制冰機(jī)(日本SANYO公司)，JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(中國(guó)新芝科器研究所),蛋白核酸檢測(cè)儀(南京大學(xué)普陽(yáng)科學(xué)儀器廠),Gene Pulser Xcell電穿孔系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD),超凈工作臺(tái)(中國(guó)蘇凈集團(tuán))，NANODROP2000(美國(guó)Thermo公司)。

圖1 pYE-GAPα質(zhì)粒示意圖

1.2 方法

1.2.1 pYE-GAPα-Lvcrustin-B質(zhì)粒的構(gòu)建 通過凡納濱對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析結(jié)果獲得Lvcrustin-B序列,采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成基因Lvcrustin-B,使用雙酶切(EcoR I和Xba I)對(duì)目的基因片段酶切產(chǎn)生特異接口,然后利用T4連接酶將酶切片段連接至pYE-GAPα載體相應(yīng)位點(diǎn),獲得重組質(zhì)粒pYE-GAPα- Lvcrustin-B。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)菌TOP10,將重組菌涂布到含有氨芐青霉素(終濃度為100 μg/mL)的LA平板,然后放置在37 ℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng),約18 h后挑取陽(yáng)性菌落，放入LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.2 pYE-GAPα-Lvcrustin-B質(zhì)粒的提取及鑒定 取擴(kuò)大培養(yǎng)菌液，放入1.5 mL離心管,以3000 r/min離心,拋棄上清,所得細(xì)菌沉淀用于質(zhì)粒提取,提取方法參照質(zhì)粒提取試劑盒(北京全式金)操作說明。將提取的質(zhì)粒分成2份,取其中1份交由華大基因公司進(jìn)行測(cè)序,1份進(jìn)行雙酶切(EcoR I和Xba I)鑒定,酶切鑒定方法參照限制性內(nèi)切酶說明書(大連寶生物公司)。

1.2.3 pYE-GAPα-Lvcrustin-B電轉(zhuǎn)酵母細(xì)胞GS115 冰浴電轉(zhuǎn)杯,將10 μL線性化質(zhì)粒pYE- GAPα-Lvcrustin-B加入到裝有80 μL畢赤酵母感受態(tài)酵母細(xì)胞的1.5 mL EP管內(nèi),混勻后加入到直徑為0.2 cm的電轉(zhuǎn)化杯中,將310 μL等滲溶液加入到電轉(zhuǎn)化杯中,然后把電轉(zhuǎn)化杯冰浴5 min。電擊條件為:電壓1700 V、時(shí)間8 ms、電擊2次。電擊完成后,將1 mL冰上預(yù)冷的濃度為1 mol/L的山梨醇溶液加入到電擊轉(zhuǎn)化杯里,用槍頭輕輕地吹打溶液，使之均勻。把電轉(zhuǎn)化杯中的全部液體轉(zhuǎn)移到新的2 mL EP管中,在30 ℃下靜置培養(yǎng)2 h。分別吸取50、100和200 μL線性化質(zhì)粒pYE-Lvcrustin-B-capsid的混合液，將其涂布于含有100 μg/mL Zeocin抗生素的YPD平板上,在30 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h,待平板長(zhǎng)出菌落后,用接種環(huán)挑取平板上生長(zhǎng)的單菌,將它接入到裝有10 YPD液體培養(yǎng)基的試管中(抗生素Zeocin濃度為100 μg/mL),在30 ℃下以180 r/min震蕩過夜培養(yǎng)。

1.2.4 PCR鑒定陽(yáng)性克隆菌株 挑選6株陽(yáng)性克隆,分別提取基因組DNA(編號(hào)分別為1、2、3、4、5、6),使用引物5′pGAP priming(5′pGAP-F:5′-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3′)和3′AOX1 priming(3′AOX1:5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.5 小試表達(dá) 取上述鑒定為陽(yáng)性的表達(dá)菌株(3號(hào)菌株)，將其接入裝有9 YPD(抗生素Zeocin 200 μg/mL)的試管中,在30 ℃下以220 r/min培養(yǎng)24 h，然后取500 μL接入到50 YPD(抗生素Zeocin 200 μg/mL)液體培養(yǎng)基中,在30 ℃下以220 r/min培養(yǎng),當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)0、24、48、72、96 h時(shí)分別從培養(yǎng)基中取樣,以10000 r/min離心2 min，收集上清液,使用SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.2.6 WB鑒定重組蛋白 取鑒定為陽(yáng)性的表達(dá)菌株,加loading buffer，煮沸冷卻后取20 μL上樣。電泳條件:5%濃縮膠，90 V 30 min;10%分離膠，120 V 20 min。轉(zhuǎn)膜:分別疊放好3層濾紙、SDS-PAGE膠和PVDF膜(PVDF膜事先需要用甲醇活化15 s左右),使用轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜,恒壓100 V 60 min。封閉:用5%脫脂奶粉PBST溶液封閉膜,搖床37 ℃ 2 h,用PBS漂洗5 min?？贵w孵育及染色(一抗為Mouse Anti-His mAb)。一抗孵育:抗體1∶500稀釋,4 ℃過夜; PBST在37 ℃漂洗5 min×3。二抗孵育:抗體1∶1500稀釋,37 ℃ 1 h;PBST在37 ℃漂洗5 min×4。曝光2 min,獲取圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 pYE-GAPα-Lvcrustin-B質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果

基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成基因Lvcrustin-B，通過克隆位點(diǎn)EcoR I和Xba I連入酵母表達(dá)載體pYE-GAPα,轉(zhuǎn)入Top10克隆菌株,然后抽提陽(yáng)性菌株質(zhì)粒送華大基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果如圖2所示，其中下劃線區(qū)域?yàn)長(zhǎng)vcrustin-B基因區(qū)域，灰色區(qū)域?yàn)槊盖形稽c(diǎn)。

圖2 陽(yáng)性菌株pYE-GAPα-Lvcrustin-B質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果

將測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的預(yù)期序列進(jìn)行比對(duì),比對(duì)結(jié)果顯示兩者100%匹配。截取部分比對(duì)序列，如圖3所示。

圖3 部分序列比對(duì)結(jié)果

2.2 pYE-GAPα-Lvcrustin-B酶切鑒定結(jié)果

用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I對(duì)抽提得到的表達(dá)質(zhì)粒pYE-GAPα-Lvcrustin-B進(jìn)行酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果見圖4。

M為核酸分子量標(biāo)尺M(jìn)arker,由下至上各條帶的大小分別為100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、5000 bp;1為酶切后質(zhì)粒;2為酶切前質(zhì)粒。

圖4 pYE-GAPα-Lvcrustin-B質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

2.3 將pYE-GAPα-Lvcrustin-B電轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞GS115

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,培養(yǎng)品經(jīng)48 h培養(yǎng)后長(zhǎng)出多個(gè)白色菌落(圖5)。

圖5 pYE-GAPα-Lvcrustin-B電轉(zhuǎn)化GS115的結(jié)果

2.4 PCR鑒定陽(yáng)性克隆菌

挑選6株陽(yáng)性克隆,分別提取基因組DNA,使用引物5′pGAP priming和3′AOX1 priming對(duì)目的基因進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果顯示均為陽(yáng)性。PCR鑒定陽(yáng)性克隆子,預(yù)期條帶大小約1.0 kD(圖6)。

2.5 小試表達(dá)SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果

SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果(圖7)顯示，培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)菌株均有陽(yáng)性,目的蛋白條帶如箭頭所示。

2.6 Lvcrustin-B蛋白WB鑒定結(jié)果

經(jīng)Western blot驗(yàn)證,純化的蛋白被抗his抗體識(shí)別,條帶大小與預(yù)期相符,證明Lvcrustin-B表達(dá)成功(圖8)。

3 討論

作為先天防御系統(tǒng)的主要成分,抗菌肽具有廣譜的生物學(xué)活性,殺菌迅速,不受傳統(tǒng)抗生素耐藥菌株的影響,與典型的抗生素具有協(xié)同作用的特點(diǎn)。隨著對(duì)抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能的破譯,以及基因工程等批量生產(chǎn)手段的出現(xiàn),抗菌肽有望成為防治水產(chǎn)養(yǎng)殖主要病害的新型藥物[11]。現(xiàn)有相關(guān)研究表明,將抗菌肽制劑添加到水產(chǎn)飼料中不僅可以提高水產(chǎn)動(dòng)物的抗病免疫力,甚至還可以提高水產(chǎn)品質(zhì)量,從而緩解水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌耐藥性及水產(chǎn)品抗生素污染等問題。陳冰等在凡納濱對(duì)蝦的研究中發(fā)現(xiàn),在一定添加水平范圍內(nèi),家蠅抗菌肽能顯著提高凡納濱對(duì)蝦的存活率、增重率、特定生長(zhǎng)率[12]。王四新等研究發(fā)現(xiàn),在飼料中添加100～150 mg/kg的凡納濱對(duì)蝦抗菌肽能顯著提高草魚的生長(zhǎng)速度和相對(duì)增重率,而添加150 mg/kg天蠶素抗菌肽對(duì)草魚存活率和肥滿度的提高效果不明顯[13]。林鑫等(2013年)將飼喂添加抗菌肽飼料的錦鯉感染維氏氣單胞菌，10 d后其累積死亡率顯著降低,充分證實(shí)口服抗菌肽可以顯著提高錦鯉的抗病能力[14]。

M為DNA Marker,從下到上各條帶的大小分別為100、250、500、750、1000、2000 bp;1～6為陽(yáng)性克隆子PCR條帶。

圖6 PCR鑒定陽(yáng)性克隆菌的結(jié)果

M: protein marker; 1、2、3、4、5: pGAPZaA-Lvcrustin-B-capsid轉(zhuǎn)化GS115菌株分別培養(yǎng)0、24、48、72、96 h。

圖7 小試表達(dá)SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果

盡管至今有數(shù)千種天然抗菌肽已經(jīng)被發(fā)現(xiàn),但目前可應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐的相關(guān)產(chǎn)品比較少,重要原因在于抗菌肽工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)有待突破?？咕淖畛跏侵苯訌膭?dòng)植物組織中提取獲得的,由于其分子量小、組織中含量低,因此分離提純存在一定的困難?；瘜W(xué)合成抗菌肽可以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn),但目前使用該方法成本較高,目前國(guó)內(nèi)肽合成價(jià)約150元/mg , 而多肽作為藥物廣泛應(yīng)用的社會(huì)可承受價(jià)格上線為10美元/mg。小于10個(gè)氨基酸殘基的多肽合成較為經(jīng)濟(jì),大于10 個(gè)殘基的多肽合成成本較高[15],同時(shí)由于缺乏天然化學(xué)修飾,其活性也難以保證。所以通過基因工程在微生物中直接表達(dá)抗菌肽基因是最佳方案。本研究利用畢赤酵母GS115成功表達(dá)了對(duì)蝦抗菌肽Lvcrustin-B,與動(dòng)植物組織提取法、化學(xué)合成方法相比,其操作簡(jiǎn)便,生產(chǎn)成本較低,非常適用于未來的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。

M: protein marker;1:空白對(duì)照;2～5:不同濃度的Lvcrustin-B蛋白樣品。

圖8 Lvcrustin-B蛋白WB鑒定結(jié)果

利用基因工程方法在微生物中表達(dá)抗菌肽有兩種方法,一種是原核表達(dá)方法,另外一種是真核表達(dá)方法。這兩種方法各有優(yōu)點(diǎn):原核表達(dá)方法的表達(dá)量比較高,但是不具有真核生物的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾能力,其產(chǎn)物往往形成沒有活性的包涵體,須經(jīng)過變性、復(fù)性等處理才能應(yīng)用,某些表達(dá)菌內(nèi)毒素含量高,表達(dá)產(chǎn)物需要經(jīng)過嚴(yán)格的純化處理;利用真核表達(dá)方法在微生物中表達(dá)抗菌肽時(shí)，由于經(jīng)過真核細(xì)胞內(nèi)特有的各種化學(xué)修飾,因此表達(dá)出來的抗菌肽活性較高,利用酵母菌表達(dá)還可以避免內(nèi)毒素的出現(xiàn),但缺點(diǎn)是表達(dá)載體構(gòu)建較為困難,有些重組蛋白不適合在真核細(xì)菌中表達(dá),因此表達(dá)量較低[16-17]。本研究利用畢赤酵母GS115表達(dá)對(duì)蝦抗菌肽Lvcrustin-B,在30 ℃下以220 r/min培養(yǎng)24 h后，取發(fā)酵液離心后的上清液進(jìn)行SDS電泳及Western blot分析,發(fā)現(xiàn)從24 h開始就檢測(cè)到有重組蛋白的存在,而且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),重組蛋白的含量越來越高,說明利用畢赤酵母GS115表達(dá)Lvcrustin-B是可行的,而且分泌表達(dá)更有利于表達(dá)產(chǎn)物的提純。以往有不少研究利用酵母菌表達(dá)重組蛋白,往往需要甲醇的誘導(dǎo),因此表達(dá)產(chǎn)物中可能存在著甲醇的殘留,因此表達(dá)產(chǎn)物需要進(jìn)一步提純?nèi)コ状汲煞植拍茏鳛樗幬锘蛘咛砑觿┦褂?。本研究采用pYE-GAPα質(zhì)粒構(gòu)建重組表達(dá)載體,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該載體轉(zhuǎn)化的酵母菌不需要甲醇誘導(dǎo)即可表達(dá),更有利于今后表達(dá)產(chǎn)物的使用。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Expression ofLitopenaeusvannameiAntimicrobial Peptide Lvcrunstin-B inPichiapastoris

LI Ming1, HE Ping-ping1, CHEN Ming1, LI Li-ping1, WANG Rui1,HUANG Ting1, CHEN Fu-yan1, MA Chun-xia2*

(1. Guangxi Academy of Fishery Sciences/Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture, Nanning 530021, China; 2. Guangxi Veterinary Research Institute, Nanning 530001, China)

According to the nucleotide sequence of antimicrobial peptide Lvcrunstin-B inLitopenaeusvannamei, the method of PAS (PCR-based Accurate Synthesis) was used for the synthesis of gene Lvcrustin-B. The synthetic gene Lvcrustin-B was doubly digested by EcoR I and Xba I, then it was ligated into the expression vector pYE-GAPα by using T4 ligase method, and the obtained recombinant yeast expression vector was named as pYE-GAPα-Lvcrustin-B. The plasmid pYE-GAPα-Lvcrustin-B was transformed intoPichiapastorisGS115 through electroporation method after linearizing by AVr II method. The transformants were screened according to their resistance to Zeocin, and then high-copy transformants were obtained. After being cultivated in a large-scale, the screened yeast transformants were induced to express with YPD medium. The results of PCR testing showed that the gene Lvcrustin-B had been steadily integrated into the chromosome ofPichiapastoris. The results of SDS-PAGE electrophoresis and Western blot experiment confirmed that the recombinant target protein Lvcrustin-B could express in a secretory manner in the yeast GS115, its molecular weight was 19.4 kD, and the optimum culture temperature for the recombinant yeast was 30 ℃.

Antimicrobial peptides;Litopenaeusvannamei; GS115; Protein expression

2016-08-31

廣西水產(chǎn)畜牧科技推廣應(yīng)用項(xiàng)目(桂漁牧科201528012)；廣西科學(xué)基金項(xiàng)目(2015GXNSFAA139067)。

黎銘(1980─),副研究員,主要從事海洋生物研究工作。*通訊作者：馬春霞。

TQ927

A

1001-8581(2017)02-0009-05