侯雪峰+孫帥+汪剛+邱輝輝+丁淑敏+劉瑩+劉丹+封亮+賈曉斌

[摘要]建立一種超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定墨旱蓮中的異槲皮苷、木犀草苷、異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯、芹菜素8種成分含量的方法。采用Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%的甲酸水，梯度洗脫條件：0～4 min，10%～13% A；4～10 min，13%～16% A；10～13 min，16%～25% A；13～17 min，25%～28% A；17～20 min，28%～40% A；20～25 min，40%～95% A。流速：0.3 mL·min^-1；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm。研究結(jié)果表明各指標(biāo)成分之間分離度良好，在選定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.999 0），平均加樣回收率（n=6）在96.60%～103.4%，RSD為0.86%～2.4%。所建立的UPLC同時(shí)測(cè)定墨旱蓮藥材中8種指標(biāo)成分的含量的方法回收率較好，重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，為墨旱蓮的鑒別及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]墨旱蓮； 超高液相色譜法； 多指標(biāo)成分； 含量測(cè)定

[Abstract]To establish an UPLC method for the simultaneous determination of 8 compounds in Eclipta Herba， such as isoquercitrin， luteoloside， demethylwedelolactone， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C， luteolin， wedelolactone and apigenin. The experiment was performed with a Waters Acquity UPLC BEH C18 （2.1 mm×100 mm， 1.7 μm） column by gradient elution of 0.1% formic acid in water and acetonitrile： 0-4 min，10%-13% A； 4-10 min， 13%-16% A； 10-13 min， 16%-25% A； 13-17 min， 25%-28% A； 17-20 min，28%-40% A；20-25 min，40%-95% A. The flow rate was 0.3 mL·min^-1 .The condition of was the colum temperature was maintained at 35 ℃ and the detected wavelength was set at 350 mm. 8 components were separated clearly by this method. Also a good linearity was obtained between the chosen concentration（r≥0.999 0）. The measured data showed that the recovery rate range from 96.60%-103.4% （n=6） and their RSD values were 0.86%-2.4%. The method has high recovery rate， good reproducibility and stability. It provides a scientific basis for the identification and quality evaluation of Eclipta Herba.

[Key words]Eclipta Herba； UPLC； multi-component quantification； content determination

doi：10.4268/cjcmm20162116

墨旱蓮為菊科植物鱧腸Eclipta prostrate L.干燥地上部分^[1]，廣泛分布于河南、安徽、江蘇、江西、浙江、福建、廣東、廣西、湖南、湖北等地^[2]。其始載于《新修本草》，有滋陰益腎涼血止血之功效。現(xiàn)代藥理研究證明，墨旱蓮具有保肝益腎^[3-4]、調(diào)節(jié)免疫^[5-6]、抗氧化^[7-8]、抗菌抗炎^[9]、抗瘧疾^[10]及抗腫瘤^[11-12]等作用，其主要化學(xué)成分主要有香豆草醚類、黃酮類、酚酸類等^[13]。目前《中國(guó)藥典》2015年版對(duì)墨旱蓮藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)依賴于蟛蜞菊內(nèi)酯單一化學(xué)成分的含量測(cè)定^[1]。然而傳統(tǒng)中藥的療效是多成分共同作用的結(jié)果，單一活性成分并不能代表藥材整體的質(zhì)量。近年來(lái)多指標(biāo)評(píng)價(jià)墨旱蓮的活性成分的報(bào)道較少，且多為2種成分同時(shí)定量^[14-15]，運(yùn)用方法多為HPLC，大多集中在某一類別化學(xué)成分的評(píng)價(jià)^[16-18]。然而HPLC耗時(shí)長(zhǎng)，其靈敏度較低，面對(duì)傳統(tǒng)中藥中低含量成分的檢測(cè)問(wèn)題時(shí)常常束手無(wú)策。

UPLC具有耐高壓、快速分離、高靈敏度、高分離度等特點(diǎn)，能克服HPLC靈敏度低，分析時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，在中藥等復(fù)雜體系的分離分析上具有明顯優(yōu)勢(shì)^[18]，被廣泛地應(yīng)用于中藥復(fù)雜體系的研究^[19-20]。本實(shí)驗(yàn)首次建立了UPLC同時(shí)測(cè)定墨旱蓮藥材中8種活性成分含量的測(cè)定方法，該方法經(jīng)試驗(yàn)認(rèn)證安全可靠簡(jiǎn)便易行，重現(xiàn)性好，溶劑消耗少，為建立墨旱蓮藥材的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供借鑒。

1 材料

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀，包括二元梯度泵、恒溫自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）以及Waters Empower 2軟件（美國(guó) Waters 公司）。Mettler Toledo MS105DU分析天平（Mettler Toledo 分析儀器有限公司）；KQ5200DE 型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

木犀草苷（批號(hào)111720-201408）、木犀草素（批號(hào)111520-201104）、蟛蜞菊內(nèi)酯（批號(hào)111885-201403）、芹菜素（批號(hào)111901-201102）和異槲皮苷（批號(hào)111809-201403）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯（批號(hào)150401）、異綠原酸A（批號(hào)150311）和異綠原酸C（批號(hào)150420）均購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，所有對(duì)照品純度均≥98.0%。甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)TEDIA公司，水為Mlliipore超純水。6個(gè)批次墨旱蓮藥材（產(chǎn)地為安徽亳州；批號(hào)分別為150722，150731，150804，150830，150922，151011）購(gòu)于精華制藥亳州康普有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室吳德康教授鑒定為菊科植物鱧腸E. prostrate的干燥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）； 流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%的甲酸水，梯度洗脫條件：0～4 min，10%～13% A；4～10 min，13%～16% A；10～13 min，16%～25% A；13～17 min，25%～28% A；17～20 min，28%～40% A；20～25 min，40%～95% A。流速0.3 mL·min^-1；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm；進(jìn)樣量2 μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 分別稱取異槲皮苷、木犀草苷、異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯、芹菜素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。依次精密量取上述8個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液適量置10 mL量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，制成含異槲皮苷42.16 mg·L^-1、木犀草苷81.60 mg·L^-1、異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯36.80 mg·L^-1、異綠原酸A 40.80 mg·L^-1、異綠原酸C 14.60 mg·L^-1、木犀草素14.20 mg·L^-1、蟛蜞菊內(nèi)酯208.00 mg·L^-1、芹菜素21.60 mg·L^-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試樣品溶液的制備 取墨旱蓮藥材粉末（過(guò)3號(hào)篩）1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入80%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量；超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min后，放至室溫，再次稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得?；旌蠈?duì)照品及供試品色譜圖見(jiàn)圖 1。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密移取上述混合對(duì)照品溶液，加80%甲醇稀釋，稀釋倍數(shù)分別為0， 2.5， 10， 20， 50， 100倍，得一系列對(duì)照品混合溶液，搖勻。在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，以各成分峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度（mg·L^-1）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和線性范圍見(jiàn)表 1。

2.5 檢出限和定量限的測(cè)定 將2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液用80%甲醇逐級(jí)稀釋后，以S/N≥3～4計(jì)算檢測(cè)限（LOD），以S/N≥10～12計(jì)算最小定量限（LOQ），結(jié)果見(jiàn)表 1。

2.6 精密度試驗(yàn) 日內(nèi)精密度：取同一混合對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算異槲皮苷、木犀草苷、異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯、芹菜素峰面積的RSD分別為0.84%，1.2%，1.6%，0.63%，0.33%，0.81%，1.1%，1.4%。日間精密度：每天1次，以混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5d，計(jì)算異槲皮苷、木犀草苷、異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯、芹菜素峰面積的RSD分別為0.97%，1.3%，1.5%，0.93%，0.83%，1.2%，1.7%，1.9%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取墨旱蓮藥材（批號(hào)150830）粉末1 g，參照2.3項(xiàng)下操作，平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，計(jì)算異槲皮苷、木犀草苷、異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯、芹菜素峰面積的RSD分別為1.7%，2.0%，2.6%，2.3%，1.1%，1.9%，2.5%，1.3%，表明重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取墨旱蓮藥材（批號(hào)150830）粉末1 g，按2.3項(xiàng)下操作，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)至棕色量瓶中，在上述色譜條件下分別在0，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣分析，計(jì)算異槲皮苷、木犀草苷、異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯、芹菜素峰面積的RSD 分別為0.86%，1.8%，2.2%，2.6%，1.3%，1.9%，2.3%，2.4%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取9份已知含量的墨旱蓮藥材（批號(hào)150830）粉末0.020 0 g，分別精密加入高、中、低3種濃度的對(duì)照品溶液適量（分別相當(dāng)于藥材原有含量的80%， 100%， 120%），每種濃度取3份，精密稱定，置離心管中，加入80%甲醇2 mL，密塞，稱定質(zhì)量；之后操作參照2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，計(jì)算平均回收率，見(jiàn)表2。8種被測(cè)成分回收率在96.60%～103.4%，RSD在0.86%～2.4%，表明方法回收率較好。

2.10 樣品含量測(cè)定 取6個(gè)批次的墨旱蓮藥材粉末，參照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，每批樣品平行測(cè)定2次，按照外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算各樣品中8種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

實(shí)驗(yàn)初期對(duì)提取溶劑進(jìn)行了考察，比較了不同濃度甲醇提取物的UPLC色譜圖，分別以純水， 40%，60%， 80%， 100%的甲醇溶劑超聲提取墨旱蓮藥材，其中以80%甲醇為提取溶劑時(shí)，色譜峰較多，且峰形好，提取效果最好。故本實(shí)驗(yàn)最終確定用80%甲醇提取效果最佳。

在考察流動(dòng)相時(shí)，有機(jī)相分別考察乙腈和甲醇，發(fā)現(xiàn)乙腈的分離效果較好，而用甲醇時(shí)色譜峰重疊、峰形差。此外，還考察了流動(dòng)相中酸的種類對(duì)峰形的影響，分別采用了乙腈-0.1%乙酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液以及乙腈-0.1%磷酸水溶液等流動(dòng)相進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相中加入酸可在一定程度上改善峰形。其中，以乙腈-0.1%甲酸水溶液的峰形最佳。

從表2中可以看出不同批次的墨旱蓮藥材中6種成分含量差異并不是很大，可能是由于藥材出自同一產(chǎn)地，且均在同一年的同一采收期購(gòu)置得到。然而墨旱蓮產(chǎn)區(qū)遍及全國(guó)各省^[2]，分布及其廣泛，且未有道地產(chǎn)區(qū)的記載。不同產(chǎn)地由于自然資源、氣候條件以及人文因素的不同^[21-22]，藥材質(zhì)量必將參差不齊。本課題組后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)不同產(chǎn)地墨旱蓮中化學(xué)成分的種類、含量及其量與量之間的關(guān)系進(jìn)行比較，以期建立科學(xué)系統(tǒng)的藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，確定不同產(chǎn)地墨旱蓮藥材成分的差異性。

無(wú)論單味藥還是復(fù)方中藥，其藥效的發(fā)揮主要還是依靠組分的整體協(xié)同作用。長(zhǎng)期以來(lái)，中藥多成分及多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)一直被大家所認(rèn)同，中藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)不能停留在單一指標(biāo)性成分上，建立多指標(biāo)成分的測(cè)定方法，有助于實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代中藥的多維質(zhì)量控制。本實(shí)驗(yàn)首次利用UPLC對(duì)墨旱蓮中的異槲皮苷，木犀草苷，異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯，異綠原酸A，異綠原酸C，木犀草素，蟛蜞菊內(nèi)酯，芹菜素等8種成分進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，分析方法靈敏、準(zhǔn)確、快速，重現(xiàn)性好，分析效率高，30 min內(nèi)即可同時(shí)完成8種成分的準(zhǔn)確測(cè)定，初步探究了墨旱蓮藥材的物質(zhì)基礎(chǔ)，為墨旱蓮藥材的評(píng)價(jià)及質(zhì)量控制提供借鑒。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]