饒桂維，李成平，王倩，活潑

(浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州 310015)

快速溶劑萃取–高效液相色譜法測(cè)定禽蛋中磺胺嘧啶*

饒桂維，李成平，王倩，活潑

(浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州 310015)

建立快速溶劑萃取–高效液相色譜法測(cè)定禽蛋中磺胺嘧啶殘留的方法。用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)禽蛋中磺胺嘧啶的萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳萃取條件：以甲醇為萃取劑，在130℃循環(huán)萃取4次，沖洗體積分?jǐn)?shù)為80%，萃取時(shí)間為25 min。色譜柱為Hypersil ODS2柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇–0.5%冰乙酸(25∶75)，流量為1.0 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm?；前粪奏さ馁|(zhì)量濃度在0.025～0.500 mg／mL范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.999 5，檢出限為0.5 μg／kg。加標(biāo)回收率在83.0%～88.2%之間，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%(n=9)。方法的精密度、準(zhǔn)確度和基質(zhì)效應(yīng)均符合禽蛋樣品檢測(cè)要求，可用于禽蛋中磺胺嘧啶含量的測(cè)定。

磺胺嘧啶；禽蛋；快速溶劑萃??；高效液相色譜法

磺胺嘧啶(SD)別名磺胺噠嗪、地亞凈，化學(xué)名稱為N-2-嘧啶基-4-氨基苯磺酰胺，是目前養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用最廣、用量最大的抗菌藥物之一，多與甲氧芐啶聯(lián)用，通過雙重阻斷細(xì)菌的葉酸合成達(dá)到抑菌的作用［1–2］。在家禽業(yè)中常用于預(yù)防和治療白痢、球蟲病、盲腸炎、肝炎及其它細(xì)菌性疾病。目前市面上銷售的禽蛋有一部分來自家庭散養(yǎng)及小規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)，因法律意識(shí)淡薄及監(jiān)管不到位，易造成禽蛋獸藥殘留超標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)磺胺類藥物毒性較高，殘留半衰期長(zhǎng)，對(duì)人體和環(huán)境危害顯著，能引起過敏反應(yīng)、細(xì)菌耐藥性和泌尿系統(tǒng)損害、造血紊亂等副作用［3–4］，歐盟已將磺胺類藥物列為嚴(yán)限使用的藥物，并規(guī)定動(dòng)物源食品中磺胺類藥物的殘留限量為0.1 μg／g［5］。

目前測(cè)定磺胺類藥物的方法主要有紫外可見光分光光度法［6］、免疫層析法［7］、電化學(xué)分析法［8］、高效液相色譜法［9］和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法［10］等。紫外可見光分光光度法簡(jiǎn)單快速，但不適合多組分磺胺類藥物測(cè)定；免疫層析法操作簡(jiǎn)單，成本低，但大多只能進(jìn)行定性分析，而且反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)；電化學(xué)分析法儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、測(cè)定范圍寬，但測(cè)定干擾因素多，對(duì)結(jié)果影響大；色譜法是目前應(yīng)用最廣泛的有機(jī)化合物測(cè)定方法，具有定性定量準(zhǔn)確、靈敏度高及干擾少等優(yōu)點(diǎn)，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法除具有色譜法優(yōu)點(diǎn)外，還具有更低的檢測(cè)限及更強(qiáng)的抗干擾力，但因儀器昂貴，不適合推廣應(yīng)用，因此筆者采用高效液相色譜法測(cè)定禽蛋中的磺胺嘧啶。

快速溶劑萃取(ASE)技術(shù)采用壓縮氣體如氮?dú)鈦砭S持系統(tǒng)的高壓防止溶劑汽化，進(jìn)而克服常壓提取對(duì)溶劑溫度的限制。樣品的提取和分離自動(dòng)完成，提取時(shí)間短，提取效率高，是一種在高溫高壓下高效萃取樣品中組分的新方法［11–12］。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(EPA)已將其收錄為樣品處理的標(biāo)準(zhǔn)方法之一，在環(huán)境、食品和藥物等領(lǐng)域用于樣品中殘留物的提?。?3–16］。故筆者利用快速溶劑萃取法萃取禽蛋中的磺胺嘧啶，先通過單因素試驗(yàn)對(duì)萃取時(shí)間、萃取溫度、沖洗體積和萃取循環(huán)次數(shù)等因素進(jìn)行考察，再經(jīng)正交試驗(yàn)確定最佳萃取參數(shù)。與常規(guī)液液萃取法相比，快速溶劑萃取法具有溶劑用量少，萃取效率高等優(yōu)勢(shì)，與固相萃取、分子印跡等處理方法相比，具有準(zhǔn)確度、自動(dòng)化程度高和處理成本較低等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

快速溶劑萃取儀：ASE–350型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；

高效液相色譜儀：FL2200型，浙江福立儀器有限公司；

冷凍干燥機(jī)：FD–1D–50型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE–3000A型，上海亞榮公司；

電子分析天平：AB204–N型，瑞士梅特勒托利多儀器有限公司；

高速萬能粉碎機(jī)：FW80型，天津泰斯特儀器有限公司；

數(shù)顯勻漿機(jī)：IKA T25 型，德國(guó)IKA公司；

低速離心機(jī)：TD4Z型，湖南凱達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)展有限公司。

磺胺嘧啶：中國(guó)藥品生物制品檢定所；

甲醇、乙酸：HPLC級(jí)；

雞蛋、鴨蛋、鵪鶉蛋樣品：購(gòu)自超市，洗凈去殼后，以10 000 r／min勻漿，冷凍干燥后，經(jīng)研缽研磨均勻，低溫下密封保存。

實(shí)驗(yàn)所用其它試劑為分析純；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 提取方法

準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品，置于萃取池內(nèi)，加適量硅藻土，設(shè)定提取時(shí)間為25 min、循環(huán)次數(shù)為4次、萃取溫度為130℃，沖洗體積分?jǐn)?shù)為80%，以甲醇為提取劑，進(jìn)行操作。提取完畢，將提取液轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，以20 000 r／min離心15 min，取上清液并在40℃水浴下氮吹至干，加入流動(dòng)相溶解，定容至1 mL，過0.22 μm 尼龍濾膜后待測(cè)。若樣品中分析物濃度過高，則用甲醇進(jìn)行適量稀釋。

1.3 色譜條件

色譜柱：依利特Hypersil ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30℃；流動(dòng)相：甲醇–0.5%冰乙酸溶液(25∶75)；流量：1 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

(1)磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。精確稱取干燥的磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，配制成1.0 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于–20℃下避光保存(2個(gè)月內(nèi)使用)。

(2)磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。移取磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇配制成所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，密封于4℃下避光保存?zhèn)溆?7天內(nèi)使用)。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取單因素試驗(yàn)考察

以甲醇為提取劑，以雞蛋空白基質(zhì)為樣品，在進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定后，選取最高回收率的加標(biāo)量加入樣品，對(duì)ASE沖洗體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取次數(shù)和提取時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)定樣品回收率，從而確定后續(xù)正交試驗(yàn)的參數(shù)范圍。

2.1.1 沖洗體積分?jǐn)?shù)

ASE的不同沖洗體積分?jǐn)?shù)對(duì)磺胺嘧啶萃取有一定影響。設(shè)定萃取時(shí)間為15 min，萃取溫度為60℃，循環(huán)次數(shù)為1次的條件下，研究不同沖洗體積分?jǐn)?shù)對(duì)磺胺嘧啶萃取效果的影響。將雞蛋空白基質(zhì)各加標(biāo)100 mg，經(jīng)ASE萃取后按1.2方法制備成供試品溶液，在1.3色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表1。

表1 不同沖洗體積時(shí)的回收率 %

由表1可知，在沖洗體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí)回收率最高；隨著沖洗體積分?jǐn)?shù)的增加，回收率逐漸穩(wěn)定，可能是沖洗比較充分，管路已無樣品殘留。故沖洗體積分?jǐn)?shù)確定為80%。

2.1.2 萃取溫度

以循環(huán)次數(shù)為1次，萃取時(shí)間為15 min，沖洗體積分?jǐn)?shù)80%為固定條件，分別取雞蛋空白基質(zhì)各加標(biāo)100 mg，與等量硅藻土混勻，置于萃取池內(nèi)，分別在60，80，100，120，140℃下萃取，通過測(cè)定萃取液中磺胺嘧啶的含量計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 不同萃取溫度時(shí)的回收率

由表2可知，磺胺嘧啶的回收率隨萃取溫度的升高而增加，在120℃之后趨于平穩(wěn)，萃取溫度升高時(shí)回收率變化不大。由于萃取儀的操作溫度范圍為40～200℃，操作溫度過高易造成各項(xiàng)儀器誤差，因此萃取溫度選擇為120℃。

2.1.3 萃取時(shí)間

分別取雞蛋空白基質(zhì)各加標(biāo)100 mg，與等量硅藻土混勻，置于萃取池內(nèi)，在萃取溫度120℃，萃取次數(shù)1次，沖洗體積分?jǐn)?shù)80%的條件下，設(shè)定萃取時(shí)間為5，10，15，20，25 min分別進(jìn)行萃取，測(cè)定磺胺嘧啶含量，計(jì)算回收率，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 不同萃取時(shí)間時(shí)的回收率

由表3可知，當(dāng)萃取時(shí)間為20 min時(shí)，磺胺嘧啶的回收率達(dá)到最大值(82.5%)，故萃取時(shí)間選擇為20 min。

2.1.4 萃取次數(shù)

在沖洗體積分?jǐn)?shù)為80%，萃取時(shí)間為20 min，萃取溫度為120℃的條件下，分別取雞蛋空白基質(zhì)各加標(biāo)100 mg，與等量硅藻土混勻，置于萃取池內(nèi)。分別萃取1，2，3，4，5次，測(cè)定萃取液中磺胺嘧啶的含量，試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，磺胺嘧啶的回收率隨著萃取次數(shù)的增加而增加，萃取3次以上時(shí)，趨勢(shì)平緩。最終選擇萃取次數(shù)為4次。

表4 不同萃取次數(shù)時(shí)的回收率

2.2 萃取正交試驗(yàn)

在完成單因素試驗(yàn)后，確定了萃取溫度、萃取時(shí)間、沖洗體積分?jǐn)?shù)和循環(huán)次數(shù)各水平的正交試驗(yàn)范圍，進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［17］，以獲得最佳的磺胺嘧啶ASE萃取條件，各因素水平見表5。

表5 各因素水平設(shè)定值

從沖洗體積分?jǐn)?shù)、萃取時(shí)間、萃取次數(shù)、萃取溫度4個(gè)因素試驗(yàn)結(jié)果中分別優(yōu)選出最優(yōu)的4個(gè)條件作為每個(gè)因素的3個(gè)水平，分別取雞蛋空白基質(zhì)各加標(biāo)100 mg，以磺胺嘧啶的回收率為考察指標(biāo)進(jìn)行考察，進(jìn)行L9(34)的正交試驗(yàn)，結(jié)果見表6。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果

在正交試驗(yàn)中，K1，K2，K3為各因素的3個(gè)水平得率的平均值，極差R表示同因素K最大值與最小值之差，極差的大小表明了因素對(duì)樣品中磺胺嘧啶萃取回收率影響的大小。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后得出，影響磺胺嘧啶萃取回收率的順序?yàn)闆_洗體積分?jǐn)?shù)＞萃取溫度＞萃取時(shí)間＞萃取次數(shù)。萃取次數(shù)影響最不明顯，這可能與ASE萃取效率比較高有關(guān)系。根據(jù)3個(gè)因素K值的大小，得出采用快速溶劑萃取法對(duì)禽蛋類磺胺嘧啶的最優(yōu)萃取條件為A2B3C3D3。即沖洗體積分?jǐn)?shù)為80%，萃取溫度為130℃，萃取時(shí)間為25 min，萃取次數(shù)為4次。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、檢出限及定量限

利用磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制質(zhì)量濃度分別為0.025，0.050，0.100，0.200，0.300，0.400，0.500 mg／mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在1.3條件下進(jìn)行測(cè)定。以磺胺嘧啶的色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=43.065X–0.453 9，r2=0.999 5，線性范圍為0.025～0.500 mg／mL。

將0.025 mg／mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液不斷稀釋進(jìn)樣分析，以3倍信噪比計(jì)算檢出限，得到磺胺嘧啶的檢出限為0.5 μg／kg；以10倍信噪比計(jì)算定量限，得方法的定量限為2.0 μg／kg。

2.4 精密度試驗(yàn)

移取0.50 mg／mL的磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)工作溶液適量，在1.3色譜條件下平行測(cè)定6次，記錄色譜峰面積，結(jié)果見表7。由表7可知，色譜峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.20%，說明該方法具有良好的精密度。

表7 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 回收試驗(yàn)

以雞蛋空白基質(zhì)作為空白樣品，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)［18］。取9份樣品分別加入50，100，150 mg／kg 3個(gè)水平的磺胺嘧啶對(duì)照品，每個(gè)水平平行測(cè)定3次。按1.2方法進(jìn)行提取，制備供試品溶液，按照1.3色譜條進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表8。由表8可知，采用3個(gè)水平、3次平行共計(jì)9次測(cè)定，平均加標(biāo)回收率為83.0%～88.2%,平均回收率為85.5%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差為2.2%，可見所建方法具有較高的精密度和準(zhǔn)確度。

表8 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.6 樣品測(cè)定

用本方法對(duì)市售的雞蛋、鴨蛋、鵪鶉蛋各10份樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中1份樣品檢出磺胺嘧啶，含量為3.12 mg／kg，其它樣品均未檢出。對(duì)照品色譜圖、陽性樣品色譜圖分別見圖1、圖2。

圖1 對(duì)照品溶液色譜圖

圖2 樣品溶液色譜圖

3 結(jié)論

(1)經(jīng)過單因素和正交試驗(yàn)確定，采用快速溶劑萃取法(ASE)萃取禽蛋中磺胺嘧啶的最佳萃取條件：沖洗體積分?jǐn)?shù)為80%，萃取溫度為130℃，萃取時(shí)間為25 min，萃取次數(shù)為4次。在該最佳萃取條件下，禽蛋中磺胺嘧啶的回收率可達(dá)85.5%。ASE萃取法具有消耗溶劑少，萃取效率高等優(yōu)點(diǎn)，在食品中非法添加劑的萃取方面具有一定的優(yōu)勢(shì)［19–20］。

(2)采用快速溶劑萃取–高效液相色譜法測(cè)定禽蛋中磺胺嘧啶含量，方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，可作為禽蛋中磺胺嘧啶含量的常規(guī)測(cè)定方法。

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Determination of Sulfadiazine in Eggs by Accelerated Solvent Extraction and High Performance Liquid Chromatography

Rao Guiwei， Li Chengping， Wang Qian， Huo Po
(College of Biology and Environmental Engineering， Zhejiang Shuren University， Hangzhou 310015， China)

A extraction and analytical method with accelerated solvent extraction (ASE) and high performance liquid chromatography was developed to determine sulfadiazine in eggs. Single factor and orthogonal experiment were adopted to optimize the extraction conditions. The results showed that the optimum conditions of extraction were as follows: methanol was as extraction solvent， 130℃for four times in 25 min and ring volume fraction of 80%. The separation of samples was carried on Hypersil ODS2 column (4.6 mm×250 mm，5 μm) with mobile phase of methanol–0.5% acetic acid(25∶75) and detection wavelength of 265 nm. The mass concentration of sulfadiazine was linear with chromatographic peak area in the range of 0.025–0.500 mg／mL with correlation coeffcient of 0.999 5. The detection limit was 0.5 μg／kg. The spiked recoveries were in the range of 83.0%–88.2% with relative standard deviation of 2.2%(n=9). The precision，accuracy，mean recoveries and the matrix effect were satisfed with the requirements of eggs measurement. The method is suitable for the determination of sulfadiazine in eggs.

sulfadiazine; egg; accelerated solvent extraction; high performance liquid chromatography

O657.6

：A

：1008–6145(2017)01–0020–05

10.3969／j.issn.1008–6145.2017.01.005

*浙江省教育廳研究項(xiàng)目(2014J80002)；浙江樹人大學(xué)校一級(jí)科研項(xiàng)目(2013A1103)

聯(lián)系人：活潑；E-mail：xka-8@163.com

2016–09–22