張興，楊玉玲，馬云，王靜宇

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023）

pH對(duì)肌原纖維蛋白及其熱誘導(dǎo)凝膠非共價(jià)鍵作用力與結(jié)構(gòu)的影響

張興，楊玉玲，馬云，王靜宇

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023）

【目的】研究pH對(duì)雞肉肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠非共價(jià)鍵作用力和結(jié)構(gòu)的影響，揭示凝膠非共價(jià)鍵作用力與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系?！痉椒ā炕預(yù)A雞宰殺，提取雞胸肉肌原纖維蛋白，配制不同pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）的肌原纖維蛋白溶液并制成熱誘導(dǎo)凝膠，運(yùn)用Zeta電位儀測定肌原纖維蛋白凝膠分子表面的電位值來表征靜電相互作用；利用拉曼光譜儀測定肌原纖維蛋白凝膠I760/I1003反映疏水相互作用變化，I850/I830反映凝膠氫鍵變化，并通過分析酰胺帶I最大峰的波數(shù)計(jì)算蛋白和凝膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量；用粒度儀測定肌原纖維蛋白粒徑大小和分布情況；用掃描電鏡觀察凝膠微觀結(jié)構(gòu)?！窘Y(jié)果】pH由7.0降至5.0，肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的Zeta電位值從-17.87顯著變化到-0.263（P＜0.05），表明肌原纖維蛋白凝膠分子表面所帶負(fù)電荷急劇減少，靜電斥力顯著減弱；歸一化強(qiáng)度I760/I1003比值由0.86逐漸增大到0.927，表明肌原纖維蛋白中色氨酸包埋程度增加，凝膠分子間的疏水相互作用增強(qiáng)；歸一化強(qiáng)度I850/I830比值從1.039減小至0.987，表明肌原纖維蛋白酪氨酸殘基苯環(huán)上-OH與水分子生成的氫鍵逐漸減少、與蛋白質(zhì)上其他基團(tuán)生成的氫鍵逐漸增加，即蛋白分子間的氫鍵作用增強(qiáng)，蛋白與水的作用減弱。pH由7.0降至6.5，肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的α-螺旋含量從59.96%降低到55.24%（P＜0.05），β-折疊含量從15.83%顯著增加到19.44%（P＜0.05），β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量都顯著增加（P＜0.05）；pH 在6.5—6.0時(shí)，各種結(jié)構(gòu)含量變化都不顯著（P＞0.05）；pH 在6.0—5.0時(shí)，肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的α-螺旋含量從51.61%降低到16.76%（P＜0.05），β-折疊含量從22.23%顯著增加到48.93%（P＜0.05），β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量都顯著增加（P＜0.05）。隨著pH降低，肌原纖維蛋白α-螺旋的含量逐漸降低，而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量都顯著增加（P＜0.05）。pH 在7.0—5.0時(shí)，肌原纖維蛋白粒徑大小逐漸增大，D10從13.4 μm上升到48.4 μm，D50從38 μm上升到253 μm，D90從236 μm上升到805 μm。pH 7.0時(shí)形成的凝膠微觀結(jié)構(gòu)有序，孔徑最大；隨著pH減小，凝膠微觀結(jié)構(gòu)有序程度降低，孔徑變??；pH 5.0時(shí)形成的凝膠微觀結(jié)構(gòu)無序、孔徑最小。pH與凝膠靜電相互作用、疏水相互作用極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與氫鍵、α-螺旋含量顯著正相關(guān)（P＜0.05），與β-折疊含量顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），這表明pH顯著影響靜電斥力、疏水相互作用、分子間氫鍵和二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。靜電相互作用、疏水相互作用、氫鍵與蛋白凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)都顯著相關(guān)（P＜0.05），表明非共價(jià)鍵作用力顯著影響二級(jí)結(jié)構(gòu)?！窘Y(jié)論】肌原纖維蛋白凝膠非共價(jià)鍵作用力、二級(jí)結(jié)構(gòu)和微觀結(jié)構(gòu)與pH密切相關(guān)；pH從7.0降到5.0，靜電斥力減小、疏水相互作用增大、分子間氫鍵增大，是α-螺旋含量減小、β-折疊含量增多以及凝膠微觀結(jié)構(gòu)變得無序、孔徑減小的原因。

肌原纖維蛋白凝膠；靜電；疏水；氫鍵；二級(jí)結(jié)構(gòu)；粒徑；微觀結(jié)構(gòu)

0 引言

【研究意義】肌原纖維蛋白（myofibrillar proteins，MP）熱誘導(dǎo)凝膠形成過程中，蛋白分子由天然狀態(tài)轉(zhuǎn)變到變性狀態(tài)，構(gòu)象改變，分子鏈伸展，各種基團(tuán)暴露，相鄰多肽鏈間吸引力和排斥力達(dá)到平衡，最終形成穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[1]。形成和維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的作用力主要有靜電相互作用、疏水相互作用、氫鍵、二硫鍵等[2]。pH通過影響肌原纖維蛋白氨基酸側(cè)鏈電荷分布，改變蛋白質(zhì)分子間的相互作用，影響蛋白質(zhì)及其熱誘導(dǎo)凝膠的非共價(jià)鍵作用力和結(jié)構(gòu)。研究pH對(duì)肌原纖維蛋白熱凝膠非共價(jià)鍵作用力和結(jié)構(gòu)的影響，探究非共價(jià)鍵作用力對(duì)蛋白質(zhì)及其凝膠結(jié)構(gòu)的控制機(jī)理，對(duì)闡述凝膠形成機(jī)制具有十分重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】LIU等[3]通過添加DTT、尿素等化學(xué)試劑研究蛋白質(zhì)間的作用力，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)熱誘導(dǎo)凝膠形成過程中非共價(jià)鍵的貢獻(xiàn)比共價(jià)鍵（二硫鍵）更大。Zeta電位是帶電顆粒表面剪切層的電位，是表征膠體體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，可用于描述膠體（如蛋白）顆粒之間的靜電相互作用[4-5]。拉曼光譜根據(jù)光子頻率變化就可判斷出分子中所含有的化學(xué)鍵或功能基團(tuán)，通過多肽鏈骨架和氨基酸側(cè)鏈振動(dòng)引起拉曼條帶強(qiáng)度改變來反映這些基團(tuán)周圍微環(huán)境的變化[6-7]。蛋白質(zhì)中的苯丙氨酸和色氨酸在拉曼光譜中出現(xiàn)的特征峰能夠反映微環(huán)境中疏水相互作用的變化[8]。酪氨酸殘基在拉曼光譜存在的兩個(gè)譜峰，能反映蛋白凝膠中酪氨酸氫鍵的變化[7]，ZHANG等[2]利用拉曼光譜法研究了壓力對(duì)肌原纖維蛋白凝膠非共價(jià)鍵作用力的影響。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈的部分氨基酸借助于氫鍵沿一維方向排列成具有周期性有規(guī)則的空間排列，主要包括 α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲等形式[9]。肌原纖維蛋白分子在拉曼光譜1 600—1 700 cm-1附近的條帶屬于酰胺帶I的伸縮振動(dòng)，是由脂肪族仲酰胺 C=O的伸縮振動(dòng)引起，部分來自Cα-C-N的彎曲振動(dòng)、C-N的伸縮振動(dòng)和N-H的面內(nèi)彎曲振動(dòng)[6,10]。通過酰胺帶I最大峰的波數(shù)可以對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析[10]。CHOI[11]用拉曼光譜法研究了普通蕎麥中球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】氫鍵等非共價(jià)鍵作用力難以量化測定，直接測量的方法幾乎沒有。傳統(tǒng)研究凝膠作用力的方法是通過添加化學(xué)試劑（如SDS、尿素等），測定凝膠特性來推測作用力變化，由于化學(xué)試劑同時(shí)影響多種作用力，其方法的科學(xué)性有待考證。拉曼光譜法從分子水平定性定量分析蛋白質(zhì)的功能基團(tuán)直接測定蛋白凝膠作用力和二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，適用高濃度的蛋白凝膠，并且無損蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，不受水的干擾[12]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在不同pH條件下用Zeta電位儀、拉曼光譜儀、粒徑儀直接測量肌原纖維蛋白凝膠的靜電作用、疏水相互作用、氫鍵、二級(jí)結(jié)構(gòu)含量、蛋白粒徑分布的變化，同時(shí)用電鏡觀察凝膠微觀結(jié)構(gòu)；探討凝膠非共價(jià)鍵作用力與結(jié)構(gòu)的關(guān)系。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年5—12月在南京財(cái)經(jīng)大學(xué)糧油質(zhì)量檢測工程技術(shù)研究中心進(jìn)行。

1.1 主要材料與試劑

活A(yù)A雞（40日齡）30只，其中公雞和母雞各15只，購于南京青龍山養(yǎng)雞場，宰殺，取雞胸肉，于-18℃下儲(chǔ)存。

試驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DS-1高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；Avanti J-26XP高效冷凍離心機(jī)，美國Beckman Coulter公司；Zeta電位分析儀（Zetasizer Malvern Nano ZS90），英國馬爾文公司；動(dòng)態(tài)光散射粒度儀（Mastersizer 2000，Malvern Instruments Ltd.，Worcester shire，UK），英國馬爾文公司；LABRAM 800激光拉曼光譜儀，法國JY公司；日本TM 300掃描電鏡，日本日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取 雞胸肉于 4℃下解凍20 min，剔除結(jié)締組織和脂肪，切碎后用于提取雞胸肉肌原纖維蛋白，蛋白提取和濃度測定方法參考文獻(xiàn)[13]。4℃下保存。

1.3.2 pH處理肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的制備 用磷酸鹽緩沖液（10 mmol·L-1K2HPO4，0.6 mol·L-1KCI，pH 6.0）溶解肌原纖維蛋白沉淀，分別配制1 mg·mL-1、40 mg·mL-1的肌原纖維蛋白溶液，用1 mol·L-1的NaOH或HCI將蛋白溶液的pH分別調(diào)至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，水浴加熱至 65℃（1℃·min-1）制成凝膠，保溫20 min，取出，自然冷卻，并在4℃下保存9—16 h，分別用于其非共價(jià)鍵作用力和結(jié)構(gòu)的測定。

1.3.3 靜電相互作用的測定 將肌原纖維蛋白凝膠樣品注入Zeta電位儀后，蓋上塞子，進(jìn)行電位測試。注意勿留氣泡。測試參數(shù)：散射角：90°，平衡時(shí)間：60 s，測試溫度：25℃。每次測定最終電位值都為連續(xù)3次測試的平均值。

1.3.4 疏水相互作用、氫鍵、二級(jí)結(jié)構(gòu)的測定 用激光拉曼光譜儀進(jìn)行測量，激發(fā)波長514.5 nm；激光出射功率：10 mW；顯微物鏡：50倍長焦距；光柵：600；狹縫：200 μm；積分時(shí)間：60 s；重復(fù)3次，累加得譜。

1.3.5 肌原纖維蛋白粒徑分布測定 將肌原纖維蛋白樣品緩慢加入Malvern動(dòng)態(tài)光散射粒度儀中，達(dá)到測試范圍，進(jìn)行測試[14]，每次測定最終粒徑分布均為連續(xù)3次測試的平均值。

1.3.6 肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察 將制備的肌原纖維蛋白凝膠切塊，用2.5%的戊二醛溶液固定2—3 h，pH 7.4的磷酸鹽清洗，進(jìn)行乙醇（50%、70%、90%、95%和100%）梯度脫水，每次20—30 min，再用叔丁醇置換，-70℃冷凍干燥，鍍膜后用掃描電鏡（SEM）觀察微觀結(jié)構(gòu)，加速電壓15 kV。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS17.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和方差分析，若方差分析效應(yīng)顯著則用Duncan multiple range test進(jìn)行多重比較（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 pH對(duì)肌原纖維蛋白凝膠靜電相互作用的影響

如圖1所示，隨著pH靠近肌原纖維蛋白等電點(diǎn)（等電點(diǎn)約為 5.0—5.2[15-16]），肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠Zeta電位絕對(duì)值顯著降低（P＜0.05），在5.0時(shí)Zeta電位值為-0.26，電位絕對(duì)值最小，在等點(diǎn)電附近，Zeta電位值接近0。中性條件下Zeta電位值為-17.87，電位絕對(duì)值最大。蛋白質(zhì)分子中幾乎所有的帶電基團(tuán)都分布在蛋白質(zhì)分子表面。在蛋白質(zhì)聚集過程中靜電相互作用通常表現(xiàn)為相互斥力，Zeta電位值為負(fù)值，表明肌原纖維蛋白呈負(fù)電荷。在等電點(diǎn)時(shí)，肌原纖維蛋白分子中正電荷和負(fù)電荷的數(shù)目接近相等，吸引和排斥的靜電作用達(dá)到平衡，此時(shí)的靜電相互作用最小，等電點(diǎn)時(shí)有利于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用[17]。靠近中性條件時(shí)，氫離子濃度減小，蛋白凝膠表面負(fù)電荷增多，Zeta電位值絕對(duì)值增大，因此，靜電斥力隨著pH的增加而增大。

圖1 pH對(duì)肌原纖維蛋白凝膠Zeta電位的影響Fig. 1 Effect of pH on the Zeta potential of myofibrillar protein heat-induced gel

2.2 pH對(duì)肌原纖維蛋白凝膠疏水相互作用的影響

苯丙氨酸和色氨酸的某些基團(tuán)在拉曼光譜中出現(xiàn)特征譜帶[6]，其中將1 003 cm-1處苯丙氨酸環(huán)的呼吸振動(dòng)作為內(nèi)標(biāo)（強(qiáng)度不隨蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而發(fā)生變化），760 cm-1處色氨酸伸縮振動(dòng)反映了微環(huán)境中疏水相互作用的變化[7]。隨著pH遠(yuǎn)離中性條件7.0，肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠760 cm-1處歸一化強(qiáng)度I760/I1003比值逐漸增大（圖 2），表明蛋白分子間疏水相互作用在pH降低時(shí)逐漸增強(qiáng)。在pH 5.0時(shí)，I760/I1003比值最大，達(dá)到0.927；在pH 7.0時(shí)，I760/I1003比值最小，為0.860，pH 5.0、5.5，pH6.0、6.5和pH 7.0這三組比值間差異顯著（P＜0.05）。離等電點(diǎn)較近時(shí)，蛋白分子間減弱的靜電斥力有利于疏水相互作用的增強(qiáng)，蛋白間的作用加強(qiáng)，蛋白與水的作用減弱[16]。遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，肌原纖維蛋白分子負(fù)電荷數(shù)量增加，靜電斥力增大，肌原纖維蛋白分子充分展開，包埋的色氨酸等疏水性氨基酸得以暴露，疏水相互作用減弱，表現(xiàn)為I760/I1003比值的減小，同時(shí)蛋白與水的作用增強(qiáng)。

圖2 pH對(duì)肌原纖維蛋白凝膠歸一化的760 cm-1處條帶強(qiáng)度的影響Fig. 2 Effect of pH on the normalized intensity of the 760 cm-1band of myofibrillar protein heat-induced gel

2.3 pH對(duì)肌原纖維蛋白凝膠氫鍵的影響

I850/I830可以反映酪氨酸殘基苯環(huán)上-OH是與溶劑水分子生成氫鍵（“暴露”式）還是與蛋白質(zhì)分子其他基團(tuán)（如-COOH）生成氫鍵（“埋藏”式）。比值I850/I830≥1.25，說明酪氨酸殘基是完全暴露在極性環(huán)境或者水環(huán)境中，如果I850/I830≤0.5，表明酪氨酸殘基處在一個(gè)埋藏的疏水環(huán)境中或者作為強(qiáng)氫鍵供體的狀態(tài)存在。比值在0.5—1.25，則表明酪氨酸殘基既有“暴露”式，又有“埋藏”式[2]。肌原纖維蛋白混合凝膠體系中，氫鍵作用包括了蛋白分子間以及蛋白分子和溶質(zhì)水之間的氫鍵作用。

如圖3所示，I850/I830比值在遠(yuǎn)離中性條件時(shí)呈下降的趨勢，在 pH 7.0時(shí) I850/I830比值最大，為1.039，在pH 5.0時(shí)I850/I830比值最小，為0.987。pH 5.0、5.5和pH 6.0、6.5、7.0這兩組比值間差異顯著（P＜0.05）。I850/I830比值在 0.5—2.5，說明酪氨酸殘基形成的氫鍵既包括暴露的氫鍵也包括埋藏的氫鍵。隨著靠近等電點(diǎn)，I850/I830比值減小表明肌原纖維蛋白酪氨酸殘基苯環(huán)上的-OH基團(tuán)與水分子生成的氫鍵逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榕c其他殘基（如-COOH）生成的氫鍵，肌原纖維蛋白肽鏈分子間的氫鍵作用增強(qiáng)，蛋白分子與水的氫鍵作用減弱。

遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，靜電斥力增大，蛋白間發(fā)生解離，基團(tuán)與基團(tuán)間氫鍵作用被破壞，導(dǎo)致蛋白分子間的氫鍵減少，肌原纖維蛋白分子展開，同時(shí)疏水性氨基酸暴露，疏水相互作用減弱，酪氨酸殘基處于一個(gè)疏水性微環(huán)境中，氫鍵與水的結(jié)合增多，故靠近中性條件是埋藏的肌原纖維蛋白分子間氫鍵轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍追肿优c水分子之間氫鍵的過程。增大的靜電斥力，使得蛋白完全伸展，在蛋白表面給水提供了更多的結(jié)合位點(diǎn)，增大水化的表面積[18]，故肌原纖維蛋白分子與水的氫鍵作用增強(qiáng)。

圖3 pH對(duì)肌原纖維蛋白凝膠歸一化的I850/I830強(qiáng)度隨的影響Fig. 3 Effect of pH on the normalized intensity of the I850/I830 doublet bands of myofibrillar protein heat-induced gel

2.4 pH對(duì)肌原纖維蛋白及其凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是指在多肽鏈的某些氨基酸殘基周期性的空間排列，包括 α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。拉曼光譜中酰胺帶 I處振動(dòng)是與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，包括高α-螺旋含量的酰胺I帶振動(dòng)主要集中在（1 655±5）cm-1處，高β-折疊含量的酰胺I帶振動(dòng)的拉曼光譜條帶主要集中在（1 670±5）cm-1，此外，還有1 680 cm-1處β-轉(zhuǎn)角和（1 665±5）cm-1處的無規(guī)則卷曲[11]。

如圖4所示，pH從7.0降到5.5，肌原纖維蛋白α-螺旋的含量從76.79%顯著降低到31.16%（P＜0.05）；pH 5.5—5.0，α-螺旋含量變化不顯著（P＞0.05）；pH 7.0—5.0，肌原纖維蛋白β-折疊含量從2.92%顯著增加到 42.33%（P＜0.05）；β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量總體呈上升的趨勢（P＜0.05）。如圖5所示，從pH 7.0到pH 6.5，肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的α-螺旋含量從59.96%降低到 55.24%（P＜0.05），β-折疊含量從15.83%顯著增加到 19.44%（P＜0.05），β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量都顯著增長（P＜0.05）；pH 6.5—6.0，各種結(jié)構(gòu)含量變化都不顯著（P＞0.05）；接近等電點(diǎn)（pH 6.0—5.0），肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的α-螺旋含量從51.61%降低到16.76%（P＜0.05），β-折疊含量從22.23%顯著增加到48.93%（P＜0.05）；β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量同樣呈上升的趨勢（P＜0.05）。肌原纖維蛋白及其熱凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量和β-折疊含量最多，隨pH降低，各種結(jié)構(gòu)變化趨勢一致，有序結(jié)構(gòu)總體減少，無序結(jié)構(gòu)總體增加，凝膠的α-螺旋含量總體較低于蛋白加熱前，β-折疊含量比蛋白加熱前較多。

α-螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定主要由單肽鏈上羰基（C=O）與（N-H）間形成的鏈內(nèi)氫鍵維持[19]，β-折疊結(jié)構(gòu)則依賴蛋白質(zhì)分子肽鏈間的氫鍵形成。靜電相互作用是影響蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的重要非共價(jià)鍵作用力之一[20]，pH通過影響帶電氨基酸和蛋白表面α-羧基、α-氨基末端基團(tuán)的質(zhì)子化狀態(tài)來影響蛋白分子間的相互作用[21]。從二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化上來看，靠近等電點(diǎn)，蛋白負(fù)電荷減少，靜電斥力減小，導(dǎo)致蛋白分子內(nèi)的氫鍵減少，氫鍵與水的結(jié)合減弱，分子間的氫鍵增多，對(duì)應(yīng)的是 α-螺旋含量減少，β-折疊含量增多。靜電斥力的減弱使得蛋白分子內(nèi)氫鍵的增多是α-螺旋含量減少的原因[22]。加熱會(huì)使α-螺旋結(jié)構(gòu)解開[23]，埋藏的疏水性氨基酸得以暴露，導(dǎo)致肌原纖維蛋白間疏水相互作用的變化，升溫過程中α-螺旋逐漸減少，β-折疊逐漸增加[24-25]，故肌原纖維蛋白凝膠的 α-螺旋含量總體比蛋白加熱前低，β-折疊含量則比蛋白加熱前多。

圖4 pH對(duì)肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響Fig. 4 Effect of pH on the secondary structure content of myofibrillar protein

圖5 pH對(duì)肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響Fig. 5 Effect of pH on the secondary structure content of myofibrillar protein heat-induced gel

2.5 pH對(duì)肌原纖維蛋白粒徑分布的影響

D10、D50、D90分別表示肌原纖維蛋白粒徑累計(jì)值達(dá)到體積10%、50%、90%時(shí)的粒徑大小，D50反應(yīng)肌原纖維蛋白的平均粒徑大小。如圖6所示，肌原纖維蛋白的粒徑大小分布在0—3 500 μm，90%的顆粒大小分布在1 000 μm以下，50%的顆粒大小分布在300 μm以下，10%的顆粒大小在50 μm以下。由表1可知，隨著pH的降低，D10從13.4 μm上升到48.4 μm，D50從38 μm上升到253 μm，pH 5.0，pH 5.5、6.0和pH 6.5、7.0這三組間差異顯著（P＜0.05）。D90從236 μm上升到805 μm，pH 5.0，pH 5.5、6.0，pH 6.5和pH 7.0這4組差異顯著（P＜0.05）。

當(dāng) pH接近等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)分子會(huì)因增大的疏水相互作用而形成隨機(jī)聚合物，隨著pH增大，增大的靜電斥力會(huì)阻止蛋白間的隨機(jī)聚集，導(dǎo)致形成線性多聚體[26]。蛋白質(zhì)粒徑變化主要由蛋白質(zhì)分子內(nèi)的交聯(lián)和聚集引起[27]?？拷入婞c(diǎn)附近時(shí)，表面凈電荷最少，靜電斥力最小，蛋白發(fā)生解聚，充分伸展，結(jié)構(gòu)變得無序，疏水基團(tuán)等活性殘基的暴露，非共價(jià)作用力形成，蛋白質(zhì)之間的作用最強(qiáng)，蛋白聚集速度最快，形成較大的聚集體，此時(shí)粒徑最大。靠近中性時(shí)，靜電斥力增大，蛋白間結(jié)合的能力減弱，不易發(fā)生聚集，此時(shí)粒徑最小。

圖6 肌原纖維蛋白粒徑分布隨pH的變化Fig. 6 Effect of pH on the particle size distribution of myofibrillar protein

表1 pH對(duì)肌原纖維蛋白粒徑大小的影響Table 1 Effect of pH on myofibrillar protein particle size

2.6 pH對(duì)肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)如圖 7所示，在 pH 5.0和5.5時(shí)，肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)中有較多球狀或棒狀的聚集塊，即不溶解的肌原纖維蛋白，pH 5.0時(shí)多孔結(jié)構(gòu)不明顯，pH 5.5時(shí)出現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)，但多孔數(shù)量較少，凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)比較無序、致密；靠近中性條件時(shí)，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)趨向有序和有層次，此時(shí)形成多孔和較大孔徑的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，不溶解的棒狀結(jié)構(gòu)消失，在pH 7.0時(shí)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑達(dá)到最大。在凈電荷數(shù)量不多時(shí)，排斥的靜電相互作用和吸引的疏水相互作用，分子間的氫鍵保持較好的平衡，易于形成有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[28]。在pH 7.0時(shí)，肌原纖維蛋白質(zhì)分子表面存在較多的負(fù)電荷，靜電排斥力占主導(dǎo)地位，因而不易發(fā)生聚集和交聯(lián)[29]，此時(shí)形成的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠孔徑較大，結(jié)構(gòu)有序。

2.7 相關(guān)性分析

由表2可見，pH與凝膠的靜電相互作用、疏水相互作用呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與氫鍵、α-螺旋含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。表明 pH顯著影響靜電斥力、疏水相互作用、分子間氫鍵和二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。靜電相互作用、疏水相互作用與凝膠α-螺旋含量顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與凝膠β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量顯著正相關(guān)（P＜ 0.05）。氫鍵與凝膠 α-螺旋含量極顯著正相關(guān)（P＜ 0.05），與凝膠 β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），表明非共價(jià)鍵作用力顯著影響二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

表2 pH與肌原纖維蛋白凝膠非共價(jià)鍵作用力、二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性Table 2 Correlation of pH, non-covalent forces, secondary structure

3 討論

肌原纖維蛋白聚集和交聯(lián)形成的熱誘導(dǎo)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)分子中引力和斥力平衡的結(jié)果，斥力由蛋白表面電荷提供，而引力是由蛋白受熱解開暴露出的功能基團(tuán)形成[30]。靠近等電點(diǎn)時(shí)，蛋白分子中正電荷和負(fù)電荷的數(shù)目接近相等，吸引和排斥的靜電作用達(dá)到平衡，此時(shí)的靜電相互作用最小，蛋白多肽鏈結(jié)構(gòu)中的非共價(jià)鍵平衡被打破，減弱的靜電斥力促進(jìn)疏水相互作用的增強(qiáng)，并減少蛋白表面的氫鍵結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致蛋白分子內(nèi)的氫鍵減少，蛋白與蛋白之間的作用增強(qiáng)，蛋白與水的作用減弱[16]。靠近中性條件時(shí)，氫離子濃度減小，蛋白表面負(fù)電荷增多，此時(shí)的靜電斥力達(dá)到最大，肌原纖維蛋白分子充分伸展，包埋的色氨酸等疏水性氨基酸得以暴露，表面疏水性增大，疏水相互作用減弱，暴露出的酪氨酸殘基處于一個(gè)疏水性微環(huán)境中，蛋白與溶質(zhì)水結(jié)合形成的氫鍵數(shù)量增多。

LIU等[22]通過圓二色譜（circular dichroism，CD）研究豬肉肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著 pH從 7.0向等電點(diǎn)靠近，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少，而β-折疊含量增多。費(fèi)英等[16]研究發(fā)現(xiàn)隨著pH偏離肌原纖維蛋白等電點(diǎn)范圍（約5—5.2），向中性條件靠近時(shí)，肌原纖維蛋白的 α-螺旋呈現(xiàn)增多的趨勢。本試驗(yàn)中隨著pH從7.0接近等電點(diǎn)，肌原纖維蛋白及其凝膠的α-螺旋含量都逐漸減少，β-折疊含量顯著增多，凝膠的α-螺旋含量相比蛋白加熱前要少，β-折疊含量則相比要多。WANG等[31]研究了肌球蛋白熱凝膠形成與其二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)蛋白凝膠形成過程中，在55℃時(shí)肌球蛋白的伸展導(dǎo)致α-螺旋的減少，在 65℃時(shí)蛋白分子間氫鍵增多導(dǎo)致β-折疊結(jié)構(gòu)的增加。在相同pH條件下，加熱導(dǎo)致α-螺旋含量的降低，β-折疊含量的增加。β-折疊結(jié)構(gòu)形成是蛋白分子聚集和交聯(lián)的前提，α-螺旋和無規(guī)則結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為β-折疊，β-折疊含量達(dá)到一定臨界水平才會(huì)形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，平行或反平行 β-折疊分子間的氫鍵使得凝膠網(wǎng)絡(luò)更加穩(wěn)定[32]。加熱使得 α-螺旋結(jié)構(gòu)解開，而后通過分子間氫鍵作用，暴露的疏水基團(tuán)之間的疏水作用形成了β-折疊結(jié)構(gòu)或β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。故本試驗(yàn)中隨著pH降低，蛋白和凝膠中的有序結(jié)構(gòu)總體減少，無序結(jié)構(gòu)總體增加。在同一pH條件下，肌原纖維蛋白凝膠相比蛋白中的 α-螺旋含量較少，而 β-折疊較多。楊玉玲等[25]通過CD法研究了從30℃加熱到80℃時(shí)肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況，發(fā)現(xiàn)其 α-螺旋含量顯著下降，β-折疊含量顯著提高，與本研究結(jié)論一致。

靜電相互作用、疏水相互作用、氫鍵與二級(jí)結(jié)構(gòu)含量都呈顯著相關(guān)（P＜0.05），表明非共價(jià)作用力顯著影響肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。α-螺旋結(jié)構(gòu)由蛋白分子內(nèi)氫鍵形成，β-折疊結(jié)構(gòu)由蛋白分子間的氫鍵形成。疏水相互作用增大使蛋白間作用加強(qiáng)，破壞了維持α-螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的肽鏈內(nèi)部氫鍵，使α-螺旋結(jié)構(gòu)解開或向其他構(gòu)象轉(zhuǎn)化[33]?？拷入婞c(diǎn)，肌原纖維蛋白負(fù)電荷減少，靜電斥力減小，導(dǎo)致蛋白分子內(nèi)的氫鍵減少，氫鍵與水的結(jié)合減少，α-螺旋含量減少，分子間的氫鍵增多，疏水相互作用形成的β-折疊含量或β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)相繼增多。靜電斥力減小，使得蛋白分子內(nèi)氫鍵減少是α-螺旋含量減少的原因，分子間的氫鍵增多是β-折疊結(jié)構(gòu)增多的原因。

加熱時(shí)，折疊的肌原纖維蛋白分子受熱變性，側(cè)鏈結(jié)合鍵斷開使得蛋白伸展，活性基團(tuán)暴露（如疏水殘基、氫鍵結(jié)合位點(diǎn)等），同時(shí)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象也發(fā)生改變，隨著溫度升高，蛋白質(zhì)分子通過活性基團(tuán)的非共價(jià)鍵作用，發(fā)生交聯(lián)和聚集形成大的膠凝體，進(jìn)而構(gòu)建復(fù)雜的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)取決于蛋白伸展和聚集的相對(duì)快慢，當(dāng)?shù)鞍椎纳煺箍煊诰奂?，此時(shí)蛋白分子能充分展開、加熱使蛋白緩慢聚集，形成有序、細(xì)致的凝膠；反之，則形成粗糙無序的凝膠結(jié)構(gòu)[34]。費(fèi)英等[16]通過 SEM 觀察發(fā)現(xiàn)豬肉肌球蛋白在等電點(diǎn)時(shí)形成粗糙、無序的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在pH 7.0時(shí)形成致密、有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。肌原纖維蛋白中疏水性氨基酸暴露與包埋引起蛋白質(zhì)間疏水相互作用變化是粒徑改變的主要原因[33]。本試驗(yàn)中疏水作用力的改變是由靜電斥力的改變引起。等電點(diǎn)時(shí)，靜電斥力最小，疏水相互作用最強(qiáng)，蛋白聚集發(fā)生在伸展之前，此時(shí)蛋白分子聚集速率最快，形成較大蛋白聚集顆粒，加熱形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)粗糙、緊密，膠孔不明顯，同時(shí)有大量球狀或棒狀的聚集塊存在。在靠近中性時(shí)，較大的靜電斥力使蛋白分子間保持分離狀態(tài)，蛋白分子充分展開，不易聚集，蛋白顆粒較?。患訜崾沟玫鞍拙徛奂?，變性鏈定向且有序，球狀或棒狀的聚集塊消失，使得凝膠微觀結(jié)構(gòu)有序，凝膠孔徑最大、數(shù)量最多。凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)影響肉制品的功能特性，韓敏義等[18]認(rèn)為在中性條件時(shí)形成的凝膠孔徑增大是其保水性上升的主要原因。

4 結(jié)論

pH顯著改變肌原纖維蛋白凝膠的靜電相互作用、疏水相互作用、氫鍵和二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。在 pH由中性靠近等電點(diǎn)時(shí)，凝膠的靜電斥力減小，疏水相互作用增大，分子間氫鍵作用增大，導(dǎo)致其α-螺旋含量減小，β-折疊含量增多。這也是凝膠微觀結(jié)構(gòu)由有序趨于無序，凝膠孔徑逐漸減小的原因。因此，肌原纖維蛋白凝膠非共價(jià)鍵作用力可決定凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)和微觀結(jié)構(gòu)。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Effects of pH on the Non-Covalent Forces and Structure of Myofibrillar Protein and Heat Induced Gel

ZHANG Xing, YANG YuLing, MA Yun, WANG JingYu
(College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, Nanjing 210023)

myofibrillar protein gel; electrostatic; hydrophobic; hydrogen bond; secondary structure; particle size; microstructure

2016-05-18；接受日期：2016-07-18

國家自然科學(xué)基金（31371798）、江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目

聯(lián)系方式：張興，E-mail：zhangxingnufe@163.com。通信作者楊玉玲，E-mail：yulingy@sina.com

Abstract:【Objective】The influence of pH on non-covalent forces and structure of myofibrillar protein heat-induced gel was studied. The relationship between gel non-covalent forces and gel structure was revealed. 【Method】 AA type broilers were slaughtered. The myofibrillar proteins were extracted from breast muscle. The myofibrillar protein solution and heat-induced gel with different pH values (5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0) were prepared. The potential on myofibrillar protein gel molecule presents the electrostatic interaction was measured by zeta potential instrument. The I760/I1003 showing the hydrophobic interaction of gel, the I850/I830 showing the hydrogen bonding of gel, and the secondary structure contents were calculated by analyzing the amide I Raman spectrum region, these were measured using Raman spectrometer. The particle size distribution was measured by a particle size analyzer. The microstructure was measured using scanning electron microscope.【Result】 From pH 7.0 to 5.0, Zeta potential value of the gel changed from -17.87 to -0.263 (P＜0.05), which show that the surface negative charges and the electrostatic interaction of myofibrillar protein gel had significant decline. The normalized intensity of 760 cm-1increased from 0.86 to 0.927, which show more Trytophan were buried and a general increase in hydrophobic interactions of myofibrillar protein gel. The normalized intensity of I850/I830 ratio decreased from 1.039 to 0.927, which indicated hydroxyl groups on the phenyl ring of tyrosine are to form hydrogen bonds with water molecules change to generate hydrogen bonds with other protein molecule residues. The interactions between myofibrillar protein molecules increased, and the interactions between myofibrillar protein and water therefore declined. From pH 7.0 to 6.5, the α-helix content of myofibrillar protein gel abruptly decreased from 59.96% to 55.24% (P＜0.05). The β-sheet content significantly increased from 15.83% to 19.44% (P＜0.05). β-turn and random coil content both significantly increased (P＜0.05). From pH 6.5 to 6.0, all structure content had no obvious change (P＞0.05). From pH 6.0 to 5.0, the α-helix content of myofibrillar protein gel significantly decreased from 51.61% to 16.76% (P＜0.05). The β-sheet content significantly increased from 22.23% to 48.93% (P＜0.05). β-turn and random coil content both significantly increased (P＜0.05). As the pH decrease, the α-helix content of myofibrillar protein gradually decreased, the β-sheet, β-turn and random coil content significantly increased (P＜0.05). From pH 7.0 to 5.0, particle size of myofibrillar protein gradually increased. D10increased from 13.4 μm to 48.4 μm, D50increased from 38 μm to 253 μm, D90increased from 236 μm to 805 μm. As the pH far away from neutral condition, the microstructure of gel changed to unordered and had smaller pore. Gel has disordered microstructure in pH 5.0, when has ordered structure at pH 7.0. The largest gel pore ware found at pH 5.0, the least were found at pH 7.0. pH had a highly negative significant correlation with electrostatic interaction and hydrophobic interactions (P＜0.01), and had a positive significant correlation with hydrogen bonding and α-helix content (P＜0.05). pH also led to negative significant change of β-sheet content (P＜0.05). These show that pH had a significant impacts on electrostatic repulsion, hydrophobic interactions, intermolecular hydrogen bonding and secondary structure. Electrostatic interaction, hydrophobic interactions and hydrogen bonding had significant correlation with secondary structure (P＜0.05), which indicated non-covalent forces had significant effects on secondary structure.【Conclusion】 Non-covalent forces and secondary structure content are significantly correlated with the pH valves. The reasons of gel α-helix reduction and β-sheet increases are the decreases of electrostatic interaction, and the increase of the hydrophobic interaction and the intermolecular hydrogen bonding of myofibrillar protein gel, as the pH far away the neutral conditions.