王芳??+康超??+李永霞??+余波+周思旋

摘要：根據(jù)GenBank中大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白MCP基因序列，設計2對特異性的引物，通過對第1步和第2步PCR反應條件進行優(yōu)化，建立大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白套式PCR診斷方法。結(jié)果表明，該方法重復性好，第1次PCR擴增敏感性達10 pg/mL，第2次PCR敏感性是1 fg/mL，對錦鯉皰疹病毒、斑點叉尾[XCZ11.tif；%95%95，JZ]病毒、嗜水氣單胞菌、檸檬酸桿菌、黃桿菌DNA擴增結(jié)果均為陰性。表明建立的套式PCR方法適合于大鯢虹彩病毒臨床樣品的快速診斷。

關(guān)鍵詞：大鯢虹彩病毒；套式PCR；臨床樣品

中圖分類號： S852.65+9.1文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0291-03

近年來，大鯢人工養(yǎng)殖發(fā)展迅速，工廠化水平較高，苗種之間流通比較多，加之今年大鯢價格下降，養(yǎng)殖戶大量采購苗種，忽視引種檢疫，造成疾病大量暴發(fā)。其中，大鯢虹彩暴發(fā)最為嚴重，在陜西、四川、貴州等地報道較多，該病毒可引起大鯢大面積死亡[1-3]。目前，大鯢虹彩病毒的疫苗還處于研究階段，市面上還沒有商品化的疫苗[4-6]。因此，對大鯢虹彩病毒病的早期診斷及防治尤為重要。本研究根據(jù)GenBank中大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白MCP基因序列，設計2對特異性的引物，根據(jù)PCR反應條件優(yōu)化，建立大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白套式PCR診斷方法，以期為臨床樣品的快速診斷、防治大鯢虹彩病毒病提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

毒株、菌株和細胞：大鯢虹彩病毒、錦鯉皰疹病毒、斑點叉尾[XCZ11.tif]病毒、嗜水氣單胞菌、檸檬酸桿菌、黃桿菌均由貴州重大疫病監(jiān)測防制重點實驗室保存。鯉上皮瘤細胞購自上海拜力生物科技有限公司。

主要試劑：MIX PCR酶、核酸染料、1×TAE電泳緩沖液、DL2000購自北京天根生物科技有限公司。細菌基因組DNA提取試劑盒，病毒基因組DNA提取試劑盒，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2試驗方法

1.2.1引物設計根據(jù)GenBank中大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白MCP基因序列，設計2對引物。

1.2.2病毒和細菌核酸的提取（1）病毒細菌核酸。將大鯢虹彩病毒液接種于鯉上皮瘤細胞，待細胞出現(xiàn)病變后收集細胞毒液，將其放入-70 ℃冰箱反復凍融3次，5 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL用病毒基因組DNA試劑盒提取基因組。（2）細菌核酸。細菌核酸DNA提取參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行。（3）組織樣品。取患病大鯢肝臟組織約1.0 g，加入0.1 mol/L PBS緩沖液2 mL進行研磨，然后置于-70 ℃反復凍融3次，5 000 r/min離心 10 min，取上清液490 μL加入10%SDS 5 μL，蛋白酶K 5 μL（20 mg/mL），55 ℃孵育30 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL用病毒基因組DNA試劑盒提取基因組。

1.2.3套式PCR擴增條件優(yōu)化對套式PCR的退火溫度（50、55、60 ℃）和引物濃度（5、10、20 μmol/L）進行優(yōu)化。第1次和第2次PCR反應體系和反應程序相同：在25 μL體系中加上下游引物各1 μL（5、10、20 μmol/L）、MIX PCR酶 12.5 μL、模板2 μL，ddH2O加至25 μL。反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃（55 ℃、60 ℃）1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳。

1.2.4敏感性試驗將提取的病毒和細菌核酸用核酸蛋白儀檢測后，進行10倍稀釋用于套式PCR反應。從每個稀釋度中取2 μL作為模板進行第1次PCR擴增，如第1次PCR擴增為陰性，再將第1次PCR產(chǎn)物取出2 μL作為模板，進行第2次PCR擴增，以確定建立的套式PCR敏感性。

1.2.5特異性試驗以大鯢虹彩病毒、錦鯉皰疹病毒、斑點叉尾[XCZ11.tif]病毒、嗜水氣單胞菌、檸檬酸桿菌、黃桿菌DNA為模板分別進行第1次和第2次PCR反應，以確定建立的套式PCR特異性。

1.2.6建立的套式PCR對臨床樣品的檢測應用建立的套式PCR對貴州省20個大鯢養(yǎng)殖場采集的46份大鯢肝臟（其中，21份為有臨床癥狀的病鯢，25份為無臨床癥狀但感染虹彩病毒的養(yǎng)殖場采集的樣品），44份大鯢餌料魚病料，20份大鯢養(yǎng)殖場水樣（其中9個養(yǎng)殖場以前發(fā)生過虹彩病毒），20份引種的鯢苗進行檢測，同時參照Mao等建立的普通PCR方法[7]進行對比。

2結(jié)果與分析

2.1套式PCR反應條件優(yōu)化

25 μL反應體系中最佳反應條件為退火溫度55 ℃，引物濃度10 μmol/L，第1次和第2次PCR能有效擴增出目的片段，分別為700、300 bp，引物間無非特異性片段產(chǎn)生（圖1）。序列送生工生物工程（上海）有限公司測序，結(jié)果與GenBank中大鯢虹彩病毒MCP基因相似性為99.9%。

2.2敏感性試驗

大鯢虹彩病毒DNA經(jīng)蛋白質(zhì)核酸儀測定濃度為 1 μg/mL，經(jīng)10倍稀釋的病毒核酸進行套式PCR，以檢測方法的敏感性。結(jié)果（圖2）表明，第1次PCR擴增產(chǎn)物大小約700 bp，大鯢虹彩病毒 DNA最低檢測量為10 pg/mL。在第1次PCR擴增未見DNA亮帶，取第1次PCR產(chǎn)物2 μL進行第2次PCR擴增，擴增產(chǎn)物大小約300 bp。第2次PCR敏感性為1 fg/mL（圖3）。

2.3特異性試驗

以大鯢虹彩病毒、錦鯉皰疹病毒、斑點叉尾[XCZ11.tif]病毒、嗜水氣單胞菌、檸檬酸桿菌、黃桿菌DNA為模板用2對引物進行PCR反應。結(jié)果（圖3、圖4）顯示，大鯢虹彩病毒DNA第1次和第2次擴增均為陽性，而錦鯉皰疹病毒、斑點叉尾[XCZ11.tif]病毒、嗜水氣單胞菌、檸檬酸桿菌、黃桿菌DNA第1次和第2次擴增均為陰性。

2.4建立的套式PCR對臨床樣品的檢測

應用建立的套式PCR檢測46份大鯢肝臟樣品陽性率為36.9%（17/46），普通PCR方法陽性率為19.5%（9/46）。套式[CM（25]PCR檢測44份大鯢餌料魚病料陽性率為0%，普通PCR[CM）]

方法陽性率為0%。套式PCR檢測20份大鯢養(yǎng)殖場水樣陽性率為10%（2/20），普通PCR方法陽性率為0%。套式PCR檢測20份引種的鯢苗陽性率為20%（4/20），普通PCR方法陽性率為15%（3/20）。

46份大鯢肝臟樣品中21份為有臨床癥狀的病鯢套式PCR檢測陽性率為42.8%（9/21），普通PCR方法陽性率為42.8%（9/21）。25份為無臨床癥狀但感染過虹彩病毒的養(yǎng)殖場采集的樣品陽性率為32%（8/25），普通PCR方法陽性率為4.7%（1/21）。9個養(yǎng)殖場以前發(fā)生過虹彩病毒水樣陽性率22.2%（2/9），普通PCR方法陽性率為0%。

3討論

近2年，隨著大鯢市場的走低，養(yǎng)殖戶對大鯢疫病防控的重視度下降。大鯢虹彩病毒是目前養(yǎng)殖大鯢最大的威脅，感染虹彩病毒可導致養(yǎng)殖場出現(xiàn)大規(guī)模大鯢死亡，而虹彩病毒的暴發(fā)多是引種所致。因此，建立快速簡便經(jīng)濟適用的引種檢疫方法對大鯢虹彩病毒病的防治尤為重要。

目前，研究者主要依據(jù)大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白設計引物建立快速的診斷方法。周勇等根據(jù)大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白設計引物，建立大鯢虹彩病毒TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法，敏感性約1.1×10-3 pg/μL病毒核酸，較之常規(guī)PCR的敏感度高出約1 000倍[8]。李惠芳等依據(jù)虹彩病毒蛙病毒屬主衣殼蛋白基因，建立虹彩病毒蛙病毒屬病毒實時熒光PCR檢測方法，該方法對虹彩病毒蛙病毒屬成員（新加坡石斑魚虹彩病毒除外）的檢測有高度的特異性，敏感性達到4.5×10-3 pg/μL，比傳統(tǒng)PCR的敏感度高出100倍[9]。這些熒光定量PCR檢測方法對人員和設備的要求較高，在基層水產(chǎn)技術(shù)推廣站推廣多只配備了普通PCR儀器，該方法推廣較難。劉星星等據(jù)大鯢蛙病毒主要核衣殼蛋白MCP設計合成4條特異性引物建立環(huán)介導等溫擴增檢測方法，最低檢測限為5 copies/μL，而巢氏PCR和常規(guī)PCR的檢測限為 50 copies/μL和5×103 copies/μL，該LAMP方法檢測時間較快，但成本較高[10]。

套式PCR成本較低，敏感性較普通PCR高100倍左右，敏感性略低于熒光定量PCR，適合基層水產(chǎn)技術(shù)推廣站推廣應用。賈坤同等依據(jù)大菱鲆紅體病虹彩病毒的腺苷三磷酸酶基因序列，設計了特異性的引物，建立了一種檢測大菱鲆紅體病虹彩病毒的套式PCR方法，該方法比普通PCR敏感性100倍[11]。本研究建立的診斷方法敏感性達到1 fg/mL，比普通PCR敏感性1 000倍。對感染過虹彩病毒的養(yǎng)殖場進行大鯢樣品和養(yǎng)殖用水樣品檢測發(fā)現(xiàn)該養(yǎng)殖場還存在陽性樣本，說明該養(yǎng)殖場可能還存在隱性感染。因此，建立的診斷方法可應用于大鯢虹彩病毒引種檢疫和隱性感染檢測，有利于大鯢養(yǎng)殖場虹彩病毒的凈化。

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