袁衛(wèi)瑜??+李軍營??+蔡慶生??+錢猛??+周宏??焦旭勇

摘要：為了從激素水平上探討烤煙葉片成熟機(jī)制，采用酶聯(lián)免疫法測定烤煙生長發(fā)育過程中葉片內(nèi)源激素的含量。結(jié)果表明：在烤煙生長發(fā)育過程中，葉片細(xì)胞分裂素（CTK）含量整體上呈下降趨勢(shì)，中部葉和上部葉CTK含量均在移栽后100 d達(dá)到峰值，此后，CTK含量呈下降趨勢(shì)；生長素（IAA）含量總體上表現(xiàn)為上升—下降的趨勢(shì)，后期IAA含量有所上升；赤霉素（GA）含量表現(xiàn)為下降—上升—下降的趨勢(shì)，整體上呈略微下降趨勢(shì)；脫落酸（ABA）含量總體上呈上升趨勢(shì)，中部葉移栽后93 d至正常采收、上部葉移栽后86 d至正常采收葉片ABA含量迅速增加。移栽100 d煙葉進(jìn)入成熟期后，葉片中CTK與ABA的比值呈明顯下降趨勢(shì)；葉片IAA與ABA的比值總體表現(xiàn)為上升—下降—上升的趨勢(shì)。綜合來看，中部葉比較適合正常采收或延遲7 d采收，上部葉比較適合延遲7 d或延遲14 d采收。

關(guān)鍵詞：烤煙；生長發(fā)育；葉片；內(nèi)源激素；動(dòng)態(tài)變化；煙葉成熟機(jī)制；適時(shí)采收

中圖分類號(hào)： S572.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0145-03

生產(chǎn)上煙葉成熟度不夠往往會(huì)導(dǎo)致煙葉內(nèi)的大分子物質(zhì)降解不充分，化學(xué)成分不協(xié)調(diào)，香氣量和香氣質(zhì)低，刺激性大[1-6]。煙葉的成熟實(shí)質(zhì)上是組成葉片的每個(gè)細(xì)胞生理功能逐漸衰退的過程，而葉片細(xì)胞的衰老與激素水平密切相關(guān)，有研究證明細(xì)胞分裂素（CTK）、生長素（IAA）、赤霉素（GA）能夠延緩葉片衰老，而脫落酸（ABA）能加速葉片衰老[7-9]。前人的研究主要集中在烤煙根系中的內(nèi)源激素含量變化上[10-11]，而對(duì)烤煙葉片內(nèi)源激素含量變化的研究卻很少[12-13]?？緹熓且环N以葉片為收獲對(duì)象的經(jīng)濟(jì)作物，因此本試驗(yàn)主要研究烤煙中部葉和上部葉在生長發(fā)育過程中內(nèi)源激素含量的動(dòng)態(tài)變化，以期掌握其變化的特點(diǎn)和規(guī)律，探討烤煙葉片成熟機(jī)制，為煙葉適時(shí)采收提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)于2012年在云南省峨山縣小街鎮(zhèn)進(jìn)行。供試烤煙品種為云87，由云南省玉溪市中煙種子有限責(zé)任公司提供。田間試驗(yàn)土壤pH值為6.87，有機(jī)質(zhì)含量為43.30 g/kg，堿解氮含量160.13 mg/kg，速效磷含量24.87 mg/kg，速效鉀含量 83.55 mg/kg。

2012年2月15日播種，4月24日移栽，6月30日統(tǒng)一打頂，種植密度為16 500株/hm2，施純氮90 kg/hm2，5月1日施提苗肥（N ∶[KG-*3]P2O5 ∶[KG-*3]K2O=28 ∶[KG-*3]0 ∶[KG-*3]5），5月10日、16日施追肥（N ∶[KG-*3]P2O5 ∶[KG-*3]K2O =12 ∶[KG-*3]6 ∶[KG-*3]24）。其他田間管理措施按優(yōu)質(zhì)煙栽培要求進(jìn)行。

1.2樣品采集及分析方法

選取田間長勢(shì)均勻的煙株，定點(diǎn)選取中部葉（自下至上第11張）和上部葉（自下至上第18張）掛牌標(biāo)記，從移栽后65 d開始，每7 d取樣1次直至移栽后100 d；然后分別于中部葉和上部葉正常采收時(shí)、延遲7 d采收時(shí)和延遲14 d采收時(shí)各取樣1次。取樣時(shí)，先將葉片表面的雜物用紗布小心擦拭干凈，然后去掉葉尖與葉基部，剔除中脈，用液氮固定。用液氮固定的鮮樣保存在-80 ℃冰箱中，取樣完畢后統(tǒng)一測定煙葉中的內(nèi)源激素含量。

內(nèi)源激素含量的測定：取鮮樣0.2 g，加1.8 mL PBS緩沖液（pH值為7.4）研磨成勻漿，于4 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，吸取上清液。用酶聯(lián)免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定CTK、IAA、GA、ABA的含量。試劑盒購于南京森貝伽生物公司。使用美國BIO-RAD680自動(dòng)酶聯(lián)測讀儀進(jìn)行D值測定，用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與D值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的D值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度。

2結(jié)果與分析

2.1烤煙生長發(fā)育過程中葉片主要內(nèi)源激素含量的變化

2.1.1烤煙生長發(fā)育過程中CTK含量動(dòng)態(tài)變化如圖1所示，CTK含量呈“雙峰”變化，葉片內(nèi)CTK含量整體上呈下降趨勢(shì)，分別于移栽后79、100 d出現(xiàn)“一小一大”2個(gè)峰值。CTK主要在根系中合成，打頂促進(jìn)根系的二次發(fā)育，因此移栽后72、79 d，烤煙葉片內(nèi)的CTK含量直線增加。移栽后 86～100 d，烤煙葉片內(nèi)的CTK含量快速增長；移栽后100 d，葉片內(nèi)CTK含量達(dá)到1.8 μg/L以上。中部葉在移栽后 100 d-正常采收葉片CTK含量略有下降，此后，CTK含量下降幅度明顯增大，上部葉CTK含量在移栽100 d以后呈直線下降趨勢(shì)。CTK能通過調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸、干擾脂質(zhì)過氧化反應(yīng)以及干擾其他激素的反應(yīng)等延緩葉片衰老[14]，因此移栽 100 d 以后烤煙葉片進(jìn)入成熟衰老階段，且下降幅度越大，進(jìn)入衰老的速度越快。

2.1.2烤煙生長發(fā)育過程中IAA含量動(dòng)態(tài)變化如圖2所示，IAA含量總體上表現(xiàn)為上升—下降—上升的趨勢(shì)，中部葉IAA含量的變化相對(duì)來說不規(guī)律，上部葉變化幅度較大。移栽后72 d，中部葉和上部葉中IAA含量都有較大幅度的增加，這可能是由于打頂去除了煙株的頂端優(yōu)勢(shì)，刺激根系合成的IAA增多，通過液流運(yùn)輸?shù)降厣系腎AA也相應(yīng)增加。中部葉和上部葉IAA含量的峰值均出現(xiàn)在移栽后93 d，較CTK含量的峰值早出現(xiàn)7 d，這可能是由于兩者促進(jìn)植物生長的時(shí)間有所不同，可見植物內(nèi)源激素是以系統(tǒng)的方式起作用的。移栽93 d以后，中部葉和上部葉IAA含量均急劇下降，說明烤煙葉片逐漸成熟。中部葉IAA含量在移栽后100 d至延遲 7 d 采收變化平穩(wěn)。中部葉延遲14 d采收時(shí)，上部葉延遲7 d和延遲 14 d 采收的IAA含量有所上升，這可能是由于IAA的作用具有雙重效應(yīng)，生長發(fā)育前期可直接調(diào)節(jié)組織對(duì)乙烯的響應(yīng)，與乙烯起相反的作用；生長發(fā)育后期又誘導(dǎo)了乙烯，促進(jìn)成熟，加速葉片衰老[15]。

2.1.3烤煙生長發(fā)育過程中GA含量的動(dòng)態(tài)變化烤煙生長發(fā)育過程中GA含量的變化如圖3所示。GA含量總體表現(xiàn)為下降—上升—下降的趨勢(shì)。在整個(gè)過程中中部葉和上部葉變化趨勢(shì)相同?？緹烥A含量在打頂后5 d（移栽后72 d）和打頂后12 d（移栽后79 d）急速下降，而劉艷芳的研究表明，打頂前葉片GA含量呈下降趨勢(shì)，打頂后2 d GA含量增加，打頂后4 d GA含量又大幅度降低，可能是由于測定時(shí)期不一樣（本研究中移栽后72 d取樣時(shí)已是打頂后5 d）[16]，導(dǎo)致與本研究結(jié)果不同。移栽100 d以后，中部葉和上部葉GA含量均呈下降趨勢(shì)，但中部葉GA含量下降幅度明顯大于上部葉，說明中部葉的衰老速度快于上部葉。由于GA的主要作用是加速細(xì)胞的伸長生長，延緩植物葉片的衰老、黃化[17]，因此葉片內(nèi)GA含量在煙株生長的中后期，整體上都呈略微下降趨勢(shì)，這與劉國順等研究的煙草生長過程中根系內(nèi)源赤霉素含量的變化規(guī)律[10]是一致的，表明隨著煙株生長進(jìn)程的由盛轉(zhuǎn)衰，煙株體內(nèi)的內(nèi)源赤霉素逐漸減少。

2.1.4烤煙生長發(fā)育過程中ABA含量的動(dòng)態(tài)變化烤煙生長發(fā)育過程中ABA含量的變化如圖4所示?？緹熤胁咳~和上部葉ABA含量呈“雙峰”變化，分別于移栽后72 d和正常采收時(shí)出現(xiàn)“一小一大”2個(gè)峰值?？緹熤胁咳~和上部葉ABA含量總體上呈上升趨勢(shì)。中部葉移栽后93 d至正常采收、上部葉移栽后86 d至正常采收烤煙葉片內(nèi)的ABA含量迅速增加，ABA含量的迅速增加啟動(dòng)了烤煙葉片的衰老[18-19]。

[FL（2K2]2.2烤煙生長發(fā)育過程中內(nèi)源激素之間的平衡關(guān)系

煙葉衰老不僅與內(nèi)源激素含量的變化有關(guān)，而且激素之間的平衡也很重要。

2.2.1烤煙生長發(fā)育過程中葉片內(nèi)CTK與ABA含量比值的動(dòng)態(tài)變化CTK與ABA含量的比值可以在一定程度上反映植株內(nèi)源激素之間的平衡關(guān)系[20]。從表1可以看出，移栽后100 d，煙葉進(jìn)入成熟期，葉片內(nèi)CTK與ABA含量的比值呈明顯下降趨勢(shì)，表明此時(shí)衰老的促進(jìn)因子ABA居于主導(dǎo)地位，CTK與ABA含量的比值降低是啟動(dòng)植物葉片衰老的主要因素[21]。最后一次測定激素含量時(shí)，烤煙中部葉和上部葉的CTK與ABA含量的比值已經(jīng)降至一個(gè)較低水平，分別為 0.014 和0.018，這與趙平等的研究結(jié)果[12]相似。

3結(jié)論與討論

葉片衰老是一個(gè)主動(dòng)過程，與營養(yǎng)物質(zhì)從植株老葉向其他部分的轉(zhuǎn)移再利用有關(guān)，內(nèi)源激素作為信號(hào)物質(zhì)可以調(diào)控植物葉片衰老。本研究結(jié)果表明，烤煙生長發(fā)育過程中，CTK含量呈“雙峰”變化，移栽后100 d中部葉和上部葉中CTK含量均達(dá)到最大值，葉片內(nèi)CTK含量整體上呈下降趨勢(shì)；IAA含量總體上表現(xiàn)為上升—下降—上升的趨勢(shì)，移栽93 d達(dá)到峰值以后，中部葉和上部葉IAA含量均急劇下降；葉片內(nèi)GA含量整體上都呈略微下降趨勢(shì)，移栽100 d以后，中部葉GA含量下降幅度明顯大于上部葉；烤煙中部葉和上部葉ABA含量均呈“雙峰”變化，總體上呈上升趨勢(shì)，中部葉和上部葉均是正常采收時(shí)ABA含量達(dá)到峰值；中部葉和上部葉CTK與ABA含量的比值在移栽100 d達(dá)到峰值以后呈明顯下降趨勢(shì)；中部葉和上部葉IAA與ABA含量的比值總體表現(xiàn)為上升—下降—上升的趨勢(shì)，移栽后93 d達(dá)到峰值，延遲14 d采收時(shí)又大幅上升，此時(shí)IAA起到加速衰老的作用。

朱中華等研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源激素是以系統(tǒng)的方式調(diào)控小麥葉片衰老的，每種激素都有不同程度的效應(yīng)，但也有主次之分[18]，把握這一點(diǎn)對(duì)生產(chǎn)上控制葉片衰老有重要意義。因此，應(yīng)該根據(jù)不同內(nèi)源激素的變化來綜合判斷煙葉適宜采收的時(shí)間。移栽后100 d，烤煙中部葉的CTK和GA含量最高，對(duì)ABA起拮抗作用，延緩衰老，此時(shí)不適宜采收；中部葉延遲14 d采收時(shí)，雖然CTK和GA含量已經(jīng)降到一個(gè)較低的水平，但此時(shí)ABA加速衰老的時(shí)間過長，加上后期IAA的促衰老作用，可能會(huì)導(dǎo)致煙葉過熟，品質(zhì)降低。因此，烤煙中部葉比較適合正常采收或延遲7 d采收，此時(shí)CTK與ABA含量的比值以及IAA與ABA含量的比值也較適中，適合采收。上部葉激素含量變化趨勢(shì)與中部葉類似，但延遲14 d采收的上部葉GA含量有所增加，此時(shí)上部葉ABA含量仍維持在一個(gè)較高的水平，因此上部葉可以延遲7 d或延遲14 d采收。

此外，通過研究烤煙生長發(fā)育過程中內(nèi)源激素含量的變化發(fā)現(xiàn)，打頂可以通過促進(jìn)根系發(fā)育使CTK、IAA、ABA含量增加，因而在生產(chǎn)上可以通過適當(dāng)?shù)姆仕芾淼却胧┐龠M(jìn)煙株根系發(fā)育，協(xié)調(diào)根冠比，調(diào)節(jié)內(nèi)源激素含量，促進(jìn)生長。當(dāng)煙株生長環(huán)境不適宜時(shí)，也可在生長后期用CTK、GA及其類似物處理，防止葉片早衰，使內(nèi)含物質(zhì)充分轉(zhuǎn)化，提高煙葉品質(zhì)。

參考文獻(xiàn)：

[1]吳杭亮，陳朝陽，何歡輝，等. 采收方式、成熟度和凋萎時(shí)間對(duì)烤煙上部葉淀粉含量的影響[J]. 武夷科學(xué)，2007，23（1）：58-64.

[2]王懷珠，楊煥文，郭紅英. 烘烤過程中不同成熟度煙葉淀粉的降解動(dòng)態(tài)[J]. 煙草科技，2004（10）：36-39.

[3]夏凱，齊紹武，周冀衡，等. 烤煙的成熟度與葉片組織結(jié)構(gòu)及葉綠素含量的關(guān)系[J]. 作物研究，2005，19（2）：102-105.

[4]張樹堂，楊雪彪. 烤煙兩種品種采收成熟度對(duì)色素和多酚化合物的影響[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，21（6）：756-760.

[5]宮長榮，王愛華，王松峰. 煙葉烘烤過程中多酚類物質(zhì)的變化與化學(xué)成分的相關(guān)分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（11）：2316-2320.

[6]張樹堂，楊雪彪. 采收成熟度對(duì)烤煙亞硝胺和煙葉品質(zhì)的影響[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，19（6）：1019-1022.

[7]Marschner H. Mineral nutrition of higher plant[M]. London：Academic Press，1986.

[8]柯學(xué)莎，李偉. 激素對(duì)水生植物生理生態(tài)的影響及其應(yīng)用[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，26（5）：1542-1549.

[9]白冰，于濤. 落葉松幼苗頂芽萌發(fā)過程中內(nèi)源激素含量的變化[J]. 林業(yè)科技，2005，30（4）：8-10.[ZK）]

[10]劉國順，秦菲，王彥亭，等. 煙草生長過程中根系內(nèi)源激素含量的變化規(guī)律[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21（4）：179-181，229.

[11]劉衛(wèi)群，丁永樂，張聯(lián)合，等. 烤煙打頂前后根系激素水平與物質(zhì)代謝的關(guān)系初探[J]. 植物生理學(xué)通訊，2002，38（4）：330-332.

[12]趙平，林克惠，鄭毅. 氮鉀營養(yǎng)對(duì)煙葉衰老過程中內(nèi)源激素與葉綠素含量的影響[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2005，11（3）：379-384.

[13]杜詠梅，郭承芳，商耀，等. 烤煙成熟過程中主要內(nèi)源激素的動(dòng)態(tài)變化研究初報(bào)[J]. 中國煙草科學(xué)，2003（3）：28-29.

[14]陳潔. 細(xì)胞分裂素對(duì)植物生長發(fā)育的影響[J]. 現(xiàn)代園藝，2012（14）：14.

[15]趙春江，康書江，王紀(jì)華，等. 植物內(nèi)源激素對(duì)小麥葉片衰老的調(diào)控機(jī)理研究[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2000，15（2）：53-56.

[16]劉艷芳. 不同施N量與打頂對(duì)雪茄外包皮煙根系傷流強(qiáng)度和內(nèi)源激素的影響[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[17]白寶璋. 植物生理學(xué)[M]. 北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，1992.

[18]朱中華，段留生，馮雪梅，等. 內(nèi)源激素對(duì)小麥葉片衰老調(diào)控的系統(tǒng)分析[J]. 作物學(xué)報(bào)，1998（2）：176-181.

[19]沈法富，喻樹迅，范術(shù)麗，等. 棉花葉片衰老過程中激素和膜脂過氧化的關(guān)系[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2003，29（6）：589-592.

[20]何萍，金繼運(yùn). 氮鉀營養(yǎng)對(duì)春玉米葉片衰老過程中激素變化與活性氧代謝的影響[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，1999，5（4）：289.

[21]Guinn G，Brummett D L.Leaf age，decline in photosynthesis，and changes in abscisic-acid，indole-3-acetic-acid，and cytokinin cotton leaves[J]. Field Crop Res，1993，32（93）：269-275.