李麗莎??+李祥龍??+毛艷朋

摘要：基于生物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫，對山羊PMEL基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為研究該基因的功能提供依據(jù)。根據(jù)GenBank中山羊PMEL基因編碼蛋白序列（GenBank登錄號：XP_005680442.1），利用ExPASy數(shù)據(jù)庫中的ProtParam、ProtScale程序分別預(yù)測理化性質(zhì)、疏水性；利用CBS Prediction Servers數(shù)據(jù)庫中的SignalP、TMHMM、Protfun程序分別預(yù)測信號肽、跨膜區(qū)及其功能；利用Predict Protein、PSORT Ⅱ Prediction、Motif Scan軟件分別預(yù)測二級結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、功能位點，并對不同物種PMEL基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明：山羊PMEL基因共編碼685個氨基酸，屬可溶性不穩(wěn)定蛋白，無信號肽，在接近肽鏈的C-端存在1個跨膜區(qū)；二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲為主，該蛋白主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮運輸、結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用；不同物種PMEL基因的系統(tǒng)進(jìn)化情況與生物進(jìn)化過程中的動物學(xué)分類相符。山羊PMEL基因編碼蛋白在生物進(jìn)化中具有較強(qiáng)保守性，該基因結(jié)構(gòu)和功能的分析為山羊PMEL基因遺傳特性的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：PMEL；山羊；生物信息

中圖分類號： Q785；S826.9+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0047-04

前黑素小體蛋白（premelanosome protein，PMEL）別稱gp100、ME20、PMEL17、silver[1]，由Sliver基因編碼，只在皮膚黑色素細(xì)胞、眼色素層黑素細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)[2]。前黑素小體蛋白是一種黑色素瘤特異性糖蛋白，對黑素小體的發(fā)育具有重要作用，通過形成蛋白水解的纖維狀矩陣從而使黑色素沉積[3]。人類PMEL基因編碼蛋白是一種黑素細(xì)胞特異性糖蛋白[4-5]，該位點編碼PMEL17蛋白，與小鼠的silver基因同源，編碼的蛋白分子質(zhì)量為70 ku，由668個氨基酸構(gòu)成；此外，該基因還編碼gp100蛋白，這2種蛋白質(zhì)通過基因交替剪接成2個競爭性3′接受位點而產(chǎn)生，由于催化活性的不同，這2個位點可產(chǎn)生2種蛋白質(zhì)[6]。在色素細(xì)胞中，黑素小體是一種專門用于合成、儲存、轉(zhuǎn)運黑素的細(xì)胞器，作為哺乳動物和其他脊椎動物的色素沉著來源[7]。PMEL作為黑素小體的一種結(jié)構(gòu)蛋白，參與黑素小體由Ⅰ期到Ⅱ期的發(fā)育，這對后期黑素小體的形成及黑色素的沉積尤為重要。動物的被毛顏色是重要的質(zhì)量性狀和經(jīng)濟(jì)性狀，PMEL基因是最優(yōu)秀的稀釋基因家族成員，該基因在鼠[8]、馬[9]、牛[10]、貓[11]、雞[12]等家養(yǎng)動物中的突變已被報道，這些突變均能使動物形成銀色表型，并逐漸損傷動物的聽覺和視覺功能。隨著人們對自然風(fēng)潮的崇尚，天然毛色羊絨和羊毛的選育、生產(chǎn)已有廣泛的市場基礎(chǔ)，但鮮有關(guān)于山羊PMEL基因結(jié)構(gòu)和功能的相關(guān)研究。本研究在已有山羊PMEL基因編碼蛋白序列的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)方法對其理化性質(zhì)、疏水性、信號肽、二級結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、功能位點及其功能進(jìn)行預(yù)測，基于鄰接法對不同物種PMEL基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，為后期研究山羊PMEL基因結(jié)構(gòu)和功能對其突變的影響提供依據(jù)。

1材料與方法

1.2方法

1.2.1山羊PMEL基因開放閱讀框的確定通過NCBI中的ORF finder確定山羊PMEL基因開放閱讀框。

1.2.2山羊PMEL基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析通過ExPASy數(shù)據(jù)庫（http：//www.expasy.org/）提供的ProtParam在線程序預(yù)測該基因編碼蛋白的氨基酸組成、等電點、正/負(fù)電荷殘基數(shù)、原子總數(shù)、摩爾消光系數(shù)、半衰期、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)、總平均親水性等；通過ProtScale軟件預(yù)測疏水性。通過CBS Prediction Servers數(shù)據(jù)庫（http：//www.cbs.dtu.dk/services/）提供的SignalP 4.1 Server在線程序判斷該基因編碼蛋白是否存在信號肽；通過TMHMM Server v.2.0軟件預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域；通過Protfun 2.2 Server軟件預(yù)測該基因編碼蛋白的功能分類。通過Predict Protein軟件（https：//www.predictprotein.org/）預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。通過PSORT Ⅱ Prediction軟件（http：//psort.hgc.jp/form2.html）預(yù)測該蛋白在細(xì)胞內(nèi)的具體存在位置。通過Motif Scan軟件（http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）預(yù)測該基因的功能位點。

1.2.3不同物種PMEL基因的系統(tǒng)發(fā)育本研究通過Clustal W程序?qū)?6個物種PMEL基因編碼蛋白序列進(jìn)行多重序列比對，并利用MrBayes軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。其中，設(shè)置原雞為外群，核酸替代模型為GTR模型（Nst=6），每個位點的替換速率為Gamma（Rates=Gamma），并運行100 000代（Ngen=100 000），每100代保存1棵樹（Samplefreq=100），舍棄老化樣本（sump burnin=250）后再將剩余的樣本構(gòu)建一致樹。

2結(jié)果與分析

2.1PMEL基因的開放閱讀框

利用NCBI中的ORF finder對山羊PMEL基因的開放閱讀框進(jìn)行定位。起始密碼子位于第14個核苷酸，終止密碼子位于第2 071個核苷酸，共編碼685個氨基酸。

2.2PMEL基因的理化性質(zhì)

利用ProtParam軟件分析山羊PMEL基因編碼蛋白的理化性質(zhì)。由該蛋白的氨基酸組成（圖1）可知，山羊PMEL基因共編碼685個氨基酸，其中亮氨酸（Leu）含量最高，占全部氨基酸的10.5%。帶負(fù)電氨基酸（Asp+Glu）、帶正電氨基酸（Arg+Lys）殘基的數(shù)量分別為53、51個。分子式為C3232H5122N890O984S26，原子總數(shù)為10 254。所有半胱氨酸形成胱氨酸（cystines）時的消光系數(shù)為98 735 L/（mol·cm），對應(yīng)的吸光度為1.352；所有半胱氨酸均不能形成胱氨酸時的消光系數(shù)為 97 860 L/（mol·cm），對應(yīng)的吸光度為1.340。哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞的半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為46.77，脂肪族氨基酸指數(shù)為84.38，親水性總平均值為-0.093。[FL）]

2.3PMEL基因的疏水性

利用ProtScale軟件分析山羊PMEL基因編碼蛋白的疏/親水性（圖2）。其中，第624位異亮氨酸（I）得分最高，為3389，表示該位點的疏水性最強(qiáng)；第66位精氨酸（R）得分最低，為-2.567，表示該位點的親水性最強(qiáng)。整條多肽鏈呈現(xiàn)為親水性，預(yù)測山羊PMEL基因編碼蛋白為可溶性蛋白。

2.4PMEL基因的信號肽

利用SignalP 4.1 Server軟件分析山羊PMEL基因編碼蛋白的信號肽（圖3）。結(jié)果顯示，C值（raw cleavage site score，原始剪切位點得分）、S值（signal peptide score，信號肽分?jǐn)?shù)）、Y值（combined cleavage site score，被結(jié)合的剪切位點的分?jǐn)?shù)）不符合1個典型信號肽（C、Y值趨向于+1；S值在切割位點之前高，而在切割位點之后降低）的標(biāo)準(zhǔn)，表明山羊PMEL基因不存在信號肽。

2.5PMEL基因的跨膜區(qū)

利用TMHMM Server v.2.0軟件分析山羊PMEL基因編碼蛋白的跨膜區(qū)（圖4）。結(jié)果顯示，存在1個跨膜區(qū)，即 618～637，表明山羊PMEL基因編碼蛋白為1個跨膜蛋白。

2.6PMEL基因蛋白的功能

通過Protfun 2.2 Server軟件預(yù)測山羊PMEL基因編碼蛋白的功能。結(jié)果顯示，該蛋白發(fā)揮運輸和結(jié)合、嘌呤和嘧啶、生物合成的輔酶因子、中央中間代謝功能的概率最高，分別為0736、0.542、0.135、0.113；在基因本體分類中發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答作用的概率最高，分別為0.141、0.111。

2.7PMEL基因的二級結(jié)構(gòu)

[JP3]通過Predict Protein軟件預(yù)測山羊PMEL基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，H（alpha-helix，α螺旋） ∶[KG-*3]E（beta-sheet，β折疊） ∶[KG-*3]L（random coil，無規(guī)卷曲）=5.55% ∶[KG-*3]1927% ∶[KG-*3]7518%，

無規(guī)卷曲在整個二級結(jié)構(gòu)中的比例較大，使蛋白質(zhì)構(gòu)象呈現(xiàn)出多樣性的特性。

2.8PMEL基因的亞細(xì)胞定位

通過PSORT Ⅱ Prediction軟件預(yù)測山羊PMEL基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，該蛋白存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、細(xì)胞質(zhì)膜的概率最高，分別為34.8%、26.1%、17.4%。

2.9PMEL基因的功能位點

通過Motif Scan軟件預(yù)測山羊PMEL基因編碼蛋白的功能位點。結(jié)果（圖5）顯示，多囊腎病區(qū)域（polycystic kidney disease domain，PKD）位于第290～330個氨基酸，蘇氨酸密集區(qū)域（threonine-rich region，THR-RICH）位于第347～451個氨基酸。[FL）]

2.10PMEL基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過貝葉斯算法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6）顯示，山羊與綿羊、家牛、野牛的親緣關(guān)系最近，與偶蹄目中單峰駝、羊駝的親緣關(guān)系也較近。食肉目中家貓與大熊貓的親緣關(guān)系最近，靈長目中黑猩猩、東非狒狒、人類、蘇門答臘猩猩的親緣關(guān)系最近，嚙齒目中小家鼠與褐家鼠的親緣關(guān)系最近。裸鼢鼠雖為嚙齒動物，但與小家鼠和褐家鼠的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與其他哺乳動物的親緣關(guān)系也較遠(yuǎn)。哺乳綱與鳥綱（原雞）之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。上述不同物種間的親緣關(guān)系與生物進(jìn)化過程中動物學(xué)分類相符合。[FL）]

3討論

前黑素小體蛋白作為一種黑素細(xì)胞特異性糖蛋白，直接參與黑素小體的生物合成，并在黑色素瘤和正常的黑色素細(xì)胞中高度表達(dá)[5]。免疫組化（immunocytochemistry）研究結(jié)果表明，在不同的毛發(fā)生長階段，黑素細(xì)胞表達(dá)的蛋白也有差異。當(dāng)毛發(fā)進(jìn)入生長期，毛球部的黑色細(xì)胞具有明顯的樹突狀結(jié)構(gòu)，前黑素小體蛋白、酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1均能表達(dá)，但在毛囊外根鞘的黑素細(xì)胞中只有前黑素小體蛋白可以表達(dá)[14]。對于前黑素小體蛋白的研究可為黑色素的集聚、黑素細(xì)胞的成熟分化提供重要依據(jù)。前黑素小體蛋白的突變主要發(fā)生在家養(yǎng)動物中，如Martnez等發(fā)現(xiàn)小鼠silv使其體內(nèi)黑色素細(xì)胞丟失，導(dǎo)致毛色變?yōu)殂y灰色[8]。Brunberg等發(fā)現(xiàn)，該蛋白的多態(tài)性與馬銀色毛色的形成具有極大相關(guān)性[9]。Menotti等發(fā)現(xiàn)，家貓SILVER位點的突變對黑色素的產(chǎn)物也有影響[11]。Schmutz等發(fā)現(xiàn)，PMEL的1個缺失和PMEL與MCIR之間的互作對能影響高原牛的毛色[15]。

利用生物信息學(xué)的方法對山羊PMEL基因編碼蛋白的氨基酸組成、疏/親水性、信號肽、跨膜區(qū)等一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、功能位點、亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測。為使預(yù)測和分析結(jié)果具有可靠性，采用多種不同軟件，且預(yù)測分析軟件所用的原理和算法各不相同，預(yù)測和分析結(jié)果具有較高的可信度[16]。推算出山羊PMEL蛋白由685個氨基酸組成，其中亮氨酸含量最高，整條多肽鏈呈現(xiàn)為親水性，無信號肽。該基因編碼蛋白是一種跨膜蛋白，存在1個跨膜區(qū)，并包含1個PKD區(qū)和蘇氨酸富集區(qū)，這與Adema等、Maresh等對前黑素小體蛋白的研究結(jié)果[17-18]一致。已有研究表明，前黑素小體蛋白17包含1個RPT重復(fù)區(qū)域（proline/serine/threonine-rich repeat domain），該區(qū)域可決定體內(nèi)黑素小體絲狀假足的形成，并影響黑色素的合成效率[13]。本研究預(yù)測出的山羊PMEL基因編碼蛋白的1個蘇氨酸富集區(qū)，可能對山羊絨（毛）的黑色素合成具有重要影響。山羊前黑素小體蛋白主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮運輸、結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。該蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成中，無規(guī)卷曲所占比例較大，使蛋白質(zhì)的構(gòu)象呈現(xiàn)出多樣性的特性。利用貝葉斯算法對PMEL基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)山羊PMEL基因與綿羊、家牛、野牛的親緣關(guān)系最近，哺乳綱與鳥綱之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，這不僅符合動物學(xué)分類，并反映了不同物種PMEL編碼蛋白結(jié)構(gòu)上的穩(wěn)定性對其生物學(xué)功能的重要意義。

4結(jié)論

山羊PMEL蛋白由685個氨基酸組成，是一種不穩(wěn)定的可溶性蛋白，無信號肽，在接近肽鏈的C-端存在1個跨膜區(qū)。該蛋白主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮運輸、結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。在二級結(jié)構(gòu)中，無規(guī)卷曲所占比例較大，使蛋白質(zhì)的構(gòu)象呈現(xiàn)出多樣性的特性。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，PMEL基因在生物進(jìn)化過程中符合動物學(xué)分類，具有較高的保守性。

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