韓志霞+馬金玉+王雪云+蔣大偉+劉芳+許蘭菊+李克宇

摘要：為使IpaC基因表達產(chǎn)物保持天然的生物學(xué)活性，實現(xiàn)在酵母表達系統(tǒng)中高效表達，本研究在不改變IpaC蛋白氨基酸序列的情況下，根據(jù)酵母密碼子偏愛性優(yōu)化合成IpaC#基因，分別構(gòu)建真核表達載體pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#，然后將線性化重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33中，對陽性轉(zhuǎn)化子用SDS-PAGE及Western blot檢測其表達產(chǎn)物。結(jié)果表明，經(jīng)SDS-PAGE及Western blot檢測，僅在pGAPZαA-IpaC#/X-33重組菌表達產(chǎn)物菌體沉淀中檢測到大小為70 ku的目的蛋白，實現(xiàn)了雞源志賀菌IpaC# 基因在畢赤酵母中的胞內(nèi)表達，從而驗證畢赤酵母表達系統(tǒng)與外源基因序列的相關(guān)性，為進一步提高雞源志賀菌IpaC基因在畢赤酵母中的高效表達提供科學(xué)依據(jù)，對研究該病的發(fā)病機制具有重要意義。

關(guān)鍵詞：雞源志賀菌；IpaC基因；畢赤酵母；優(yōu)化密碼子；pGAPZαA；真核表達

中圖分類號：Q786；S852.61 文獻標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0039-04

志賀菌可以感染多種物種，不僅是人，志賀菌還可以引起豬、鼠、狐貍、兔、牛等多種動物痢疾，其中以幼年動物患病率最高，嚴重的會導(dǎo)致死亡[1]。在志賀菌侵襲腸道過程中，毒力大質(zhì)粒上Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的IpaC蛋白通過介導(dǎo)細胞骨架重排而使志賀菌趁機侵入腸上皮細胞，而且只有重組純化的IpaC蛋白才能夠在一定程度上恢復(fù)志賀菌的侵襲能力[2]。在分子水平上，IpaC蛋白不同結(jié)構(gòu)域具有不同生物學(xué)功能[3-5]。志賀菌對人的侵襲感染機制的研究比較深入。雞源志賀菌擁有與人源菌株相同的IpaC蛋白分子[6-8]，但是至今尚不清楚雞腸上皮細胞是否存在與人腸上皮細胞相似的IpaC蛋白受體分子。目前，雞源志賀菌IpaC基因的克隆表達在原核表達系統(tǒng)表達技術(shù)已經(jīng)比較成熟[9-11]，但目前國內(nèi)外在畢赤酵母表達系統(tǒng)中的研究較少。因此，為使IpaC基因表達產(chǎn)物保持天然的生物學(xué)活性，為研究雞腸上皮細胞上的IpaC蛋白受體分子提供研究基礎(chǔ)，本研究通過根據(jù)酵母表達系統(tǒng)對密碼子的偏愛性，對雞源志賀菌IpaC基因進行優(yōu)化合成，分別構(gòu)建真核表達載體pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#，使IpaC和IpaC#整合到酵母染色體中，從而驗證畢赤酵母表達系統(tǒng)與外源基因序列的相關(guān)性，為進一步提高雞源志賀菌IpaC基因在畢赤酵母中的高效表達提供科學(xué)依據(jù)，對研究該病的發(fā)病機制具有重要意義。

1材料與方法

1.1菌株及載體

原核重組載體pET32a-IpaC/BL21為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院微生物學(xué)實驗室構(gòu)建保存；酵母真核載體pGAPZαA由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)尹清強教授惠贈；宿主菌大腸桿菌（Escherichia coli） TOP10購自上海北諾生物技術(shù)有限公司；畢赤酵母菌株X-33為河南科技大學(xué)張春杰教授惠贈。

1.2酶與試劑

rTaq DNA聚合酶、DL2000、DL5000均購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XbaⅠ均購自Fermentas公司（美國）；T4連接酶購自于New England Biolabs（英國）公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒及質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR引物合成和重組質(zhì)粒的測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。蛋白胨、酵母膏、Agar power均購自O(shè)XIOD公司；瓊脂糖凝膠購自GENVIEW公司；ZeocinTM購自invitrogen公司；鼠源 6-His單克隆抗體（Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody），購自美國Abbkine試劑公司；羊抗小鼠IgG-HRP，購自索萊寶公司；IpaC蛋白免疫血清及雞源志賀菌滅活疫苗免疫血清均由筆者實驗室制備并保存。

1.3IpaC#基因序列的合成

根據(jù)酵母密碼子偏愛性，在不改變氨基酸序列的情況下，對IpaC基因原序列進行優(yōu)化，由北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司合成，并將基因序列克隆到pUCE載體上，命名為pUCE-IpaC#。

1.4引物設(shè)計與合成

根據(jù)雞源志賀菌IpaC基因與IpaC#基因全序列及畢赤酵母表達載體pGAPZαA多克隆位點序列分別設(shè)計1對引物P1、P2和P3、P4，上游引物加上EcoRⅠ、下游引物加上XbaⅠ這2個酶切位點（斜體加粗為酶切位點），并根據(jù)載體pGAPZαA序列設(shè)計檢測引物P5、P6，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，已經(jīng)進行特異性檢測。序列如下：

1.5重組載體構(gòu)建

分別以pET32a-IpaC和pUCE-IpaC#為模板進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并切下目的條帶，用普通瓊脂糖凝膠試劑盒回收目的片段?；厥债a(chǎn)物和質(zhì)粒pGAPZαA用EcoRⅠ和XbaⅠ限制性內(nèi)切酶同時進行雙酶切并經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，分別將IpaC和IpaC#基因雙酶切產(chǎn)物與載體pGAPZαA雙酶切產(chǎn)物在T4連接酶的作用下16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌TOP10，在含ZeocinTM抗性平板上進行篩選。挑取陽性單克隆，經(jīng)菌液PCR、質(zhì)粒雙酶切鑒定和序列分析。獲得的重組質(zhì)粒命名為pGAPZαA-IpaC、pGAPZαA-IpaC#。

1.6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母宿主菌X-33

大量提取質(zhì)粒pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#，用限制性內(nèi)切酶AvrⅡ進行單酶切線性化，電泳后用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，分別電轉(zhuǎn)化至酵母菌X-33感受態(tài)細胞中，電轉(zhuǎn)條件為：1.6 kV，25 μF，400 Ω，電擊時間43 ms。電擊完畢后，馬上將1 mL冰預(yù)冷的1 mol/L山梨醇溶液加入菌體中，吹打混勻，轉(zhuǎn)至1.5 mL EP管中，30 ℃靜置培養(yǎng)1～2 h。取100 μL菌體懸液涂布于含有抗生素Zeocin濃度為100 μg/mL的YPD固體培養(yǎng)基上，待菌液完全吸收后，將平板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d，直至單菌落出現(xiàn)，同時電轉(zhuǎn)空質(zhì)粒pGAPZαA作對照。

1.7高抗篩選

挑取在ZeocinTM濃度為100 μg/mL平板上的單菌落，分別刺種在ZeocinTM濃度為500、1 000、2 000 μg/mL的YPD平板上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，直至有單菌落出現(xiàn)。將高抗性陽性克隆接種于Zeocin濃度為100 μg/mL的YPD平板上培養(yǎng)2～3 d，直至有單菌落出現(xiàn)。將高抗陽性轉(zhuǎn)化子按照酵母基因組DNA小量提取試劑盒說明書操作提取酵母基因組DNA，利用檢測引物P5、P6進行PCR擴增，并將PCR擴增產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.8重組畢赤酵母表達產(chǎn)物檢測

挑取鑒定正確的重組酵母單菌落接種于液體YPD培養(yǎng)基中，于30 ℃、250 r/min下振蕩培養(yǎng)過夜。次日，取0.2 mL過夜培養(yǎng)物接種于100 mL液體YPD培養(yǎng)基中，于30 ℃、250 r/min 下振蕩培養(yǎng)。分別在0、24、32、48、60、72、84、96、108、120、144 h的各個時間點收集上清和細胞樣品10 mL，用于SDS-PAGE及Western blot分析，同時設(shè)立pGAPZαA/X-33表達為對照組。將各個不同時間點收集的菌液在4 ℃離心機中，于5 000 r/min下離心5 min，分別取菌體沉淀和上清。沉淀轉(zhuǎn)移至無菌的EP管中。將收集的培養(yǎng)基上清用超濾法濃縮后進行SDS及Western blot檢測。Western blot分別用His單抗、IpaC蛋白免疫血清及雞源志賀菌滅活疫苗免疫血清進行特異性檢測。

2結(jié)果與分析

2.2重組載體的鑒定結(jié)果

挑取轉(zhuǎn)化后平板上的單菌落過夜培養(yǎng)，各取1 μL作模板進行PCR擴增，結(jié)果顯示，電泳出現(xiàn)1條約1 107 bp的特異性條帶，與目的基因片段大小一致（圖1-A）。提取的質(zhì)粒pGAPZαA-IpaC#和pGAPZαA-IpaC經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切電泳出現(xiàn)2條帶，其中1條條帶為載體質(zhì)粒，約3 084 bp，另1條條帶片段長約1 097 bp，酶切結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相一致（圖1-B）。對重組質(zhì)粒測序結(jié)果分析，結(jié)果表明IpaC基因及IpaC#基因均位于pGAPZαA質(zhì)粒α因子信號肽序列下游，具有正確的閱讀框。

2.3高抗性陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定

以轉(zhuǎn)化有線性化的重組質(zhì)粒pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#的酵母基因組為模板，以α-Factor sequencing primer和3′ AOX1 sequencing primer為引物進行PCR，若線性化的含目的基因的重組質(zhì)粒與酵母成功重組則應(yīng)擴增出[FL）]

長度為1 333 bp的片段，線性化的質(zhì)粒pGAPZαA與酵母成功重組則應(yīng)擴增出長度為299 bp的小片段，pGAPZαA-IpaC為陽性對照。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測，結(jié)果（圖2）與預(yù)期一致，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序，線性化的重組質(zhì)粒已經(jīng)成功整合到酵母基因組中。

2.4重組酵母表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳結(jié)果

分別挑取pGAPZαA-IpaC/X-33和pGAPZαA-IpaC#/X-33陽性酵母菌培養(yǎng)表達，不同時間取的樣品中上清和菌體沉淀進行SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色，與空載體對照菌比較X-33菌體沉淀樣品用帶His單抗作Western blot檢測，結(jié)果如圖4-A所示，菌體沉淀中蛋白大小位置與預(yù)期一致，在108 h時表達量最高。將84、96、108、120、144 h取得的樣品用IpaC蛋白免疫后血清抗體作Western blot檢測，結(jié)果如圖4-B所示，蛋白大小位置與預(yù)期一致。將84、96、108、120、144 h取得的樣品用志賀菌全菌體疫苗菌免疫的血清抗體作Western blot檢測，結(jié)果如圖4-C所示，蛋白大小位置與預(yù)期一致。

3結(jié)論與討論

真核表達系統(tǒng)克服了原核表達系統(tǒng)持續(xù)表達可能會對宿主細胞產(chǎn)生毒害作用，過量表達可能導(dǎo)致非生理反應(yīng)，目的蛋白常以包涵體形式表達，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難的缺點，而真核表達系統(tǒng)能誘導(dǎo)基因的高效表達，可達105倍，為其他系統(tǒng)所不及，可以嚴格調(diào)控基因表達，人為地調(diào)控基因表達量。因此，利用真核表達系統(tǒng)來表達目的蛋白越來越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達系統(tǒng)有酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。[FL）]

畢赤酵母表達系統(tǒng)可使外源對蛋白進行加工修飾，使得表達的外源蛋白具有類似天然蛋白質(zhì)的構(gòu)象[12]。而本研究選擇的真核表達載體pGAPZαA以GAP為啟動子，在表達過程中不須要添加甲醇，操作更為簡單，其含有α信號因子，利用該信號因子可將目的蛋白分泌到培養(yǎng)基中獲得純度較高的蛋白[13-14]。

影響外源基因在畢赤酵母中表達量的因素很多，其中外源基因自身的特點是影響表達量的重要因素，包括密碼子使用情況、GC含量等。國內(nèi)外很多研究通過將外源基因的密碼子進行優(yōu)化，使外源基因的密碼子使用頻率符合畢赤酵母的密碼子偏好性的要求，取得很好的效果[15-18]。本研究通過對IpaC基因的分析發(fā)現(xiàn)，該基因中含有畢赤酵母的稀有密碼子，基于這種情況，本研究根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性，對雞源志賀氏菌來源的IpaC基因進行優(yōu)化改造，在不改變其氨基酸序列的基礎(chǔ)上，選擇畢赤酵母偏愛型的密碼子，并調(diào)整基因的GC含量，使其更加符合畢赤酵母的要求。優(yōu)化后的IpaC#基因與原始IpaC基因序列相比，共改變了269個堿基，涉及207個氨基酸，GC含量由原來的38.83%變?yōu)?40.02%，而在畢赤酵母中GC含量一般為40%～42%，優(yōu)化合成的目的基因GC含量與畢赤酵母相符。

本研究分別構(gòu)建了真核表達載體pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#，重組菌的表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE及Western blot檢測，在pGAPZαA-IpaC重組菌菌體沉淀和表達上清中均沒有檢測到目的蛋白，而在pGAPZαA-IpaC#重組菌菌體沉淀中檢測到目的蛋白大小約為70 ku，這進一步驗證了畢赤酵母真核表達系統(tǒng)與外源基因本身有關(guān)[19-20]。而在pGAPZαA-IpaC#重組菌表達培養(yǎng)基上清中并未檢測到目的蛋白，有可能是因為IpaC蛋白本身具有膜結(jié)合區(qū)，在分泌過程中與酵母細胞發(fā)生結(jié)合，也有可能是α信號肽與IpaC基因在一定程度上不匹配，為后期進一步研究IpaC蛋白在畢赤酵母中的高效表達奠定基礎(chǔ)。在后續(xù)試驗中，更換信號肽序列或者優(yōu)化信號肽序列密碼子可能使IpaC蛋白高效分泌表達。

參考文獻：[HJ1.4mm]

[1]許蘭菊，王川慶，胡攻政，等. 雞志賀氏菌在我國的發(fā)現(xiàn)及其病原特性研究[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2004，26（4）：281-286.

[2]Terry C M，Picking W L，Birket S E，et al. The C-terminus of IpaC is required for effector activities related to Shigella invasion of host cells[J]. Microbial Pathogenesis，2008，45（4）：282-289.

[3]Shaikh N，Terajima J，Watanabe H. IpaC of Shigella binds to the C-terminal domain of β-catenin[J]. Microbial Pathogenesis，2003，35（3）：107-117.

[4] Brzu S，Benjelloun-Touimi Z，Phalipon A，et al. Functional analysis of the Shigella flexneri IpaC invasin by insertional mutagenesis[J]. Infection and immunity，1997，65（5）：1599-1605.

[5] Kim S，Kim J，Seo G. Iron oxide nanoparticle-impregnated powder-activated carbon （IpaC） for NOM removal in MF membrane water treatment system[J]. Desalination and Water Treatment，2013，51（31/32/33）：6392-6400.

[6]劉紅英. 人志賀菌對雛雞的致病性及人、雞志賀菌某些重要基因的比較研究[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[7]楊霞，陳陸，許蘭菊，等. 雞源鮑氏志賀菌hn03株的分子鑒定與演化分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2009，40（3）：402-408.

[8]楊霞. 利用分子遺傳標(biāo)記技術(shù)對雞鮑氏志賀菌的鑒定和菌株起源研究[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[9]苗銀萍，蔣大偉，許蘭菊，等. 雞源志賀菌IpaC基因的克隆及原核表達[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2013，33（9）：1352-1357.[ZK）]

[10]陳志寶，宋博翠. 弗氏志賀菌侵襲性基因IpaC誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建及其自激活作用[J]. 中國生物制品學(xué)雜志，2010，23 （6）：590-593.

[11]孫素霞，王紅，王勇，等. 福氏志賀氏菌毒力基因IpaC在大腸桿菌中表達的初步研究[J]. 中國人獸共患病雜志，2003，19（6）：29-31.

[12]Ahmad M，Hirz M，Pichler H，et al. Protein expression in Pichia pastoris：recent achievements and perspectives for heterologous protein production[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2014，98（12）：5301-5317.

[13]Borgheresi R A M B，Palma M S，Ducancel F，et al. Expression and processing of recombinant sarafotoxins precursor in Pichia pastoris[J]. Toxicon，2001，39（8）：1211-1218.

[14]Li J W，Liu Y，Li K，et al. Cloning of a fusion gene containing hGM-CSF gene and gene encoding L protein of HBV and expression in Pichia pastoris[J]. Hepato-Gastroenterology，2009，57（99/100）：578-582.

[15]Scorer C A，Buckholz R G，Clare J J，et al. The intracellular production and secretion of HIV-1 envelope protein in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J]. Gene，1993，136（1/2）：111-119.[HJ1.6mm]

[16]姚斌，張春義，王建華. 高效表達具有生物活性植酸酶的畢赤酵母[J]. 中國科學(xué)C輯，1998，28（3）：237-243.

[17]陳惠，趙海霞，王紅寧，等. 植酸酶基因中稀有密碼子的改造提高其在畢赤酵母中的表達量[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2005，21（2）：171-175.

[18]Chang S W，Shieh C J，Lee G C，et al. Multiple mutagenesis of the Candida rugosa [WTBX][STBX]LIP1[WTBZ][STBZ] gene and optimum production of recombinant LIP1 expressed in Pichia pastoris[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2005，67（2）：215-224.

[19]陳熙，陳毓，齊小雨，等. 人溶菌酶定點突變基因在畢赤酵母中的表達及活性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，30（6）：1396-1401.

[20]董亞青，朱文斗，王琳琳，等. 雞α-干擾素在畢赤酵母中的表達及其表達條件優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11）：275-277.