劉艷紅，呂淑霞*，李 穎，李 森，王 瀾，馬 鏑

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866；2.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心動(dòng)物安全檢測(cè)室，北京 102600；3.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866）

大腸桿菌耐藥性及氟苯尼考耐藥基因floR的研究

劉艷紅1，呂淑霞1*，李 穎2，李 森3，王 瀾1，馬 鏑1

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866；2.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心動(dòng)物安全檢測(cè)室，北京 102600；3.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866）

本實(shí)驗(yàn)對(duì)某地養(yǎng)殖場(chǎng)豬源和雞源大腸桿菌的耐藥性及氟苯尼考耐藥基因floR進(jìn)行分析，旨在了解我國(guó)大腸桿菌的耐藥現(xiàn)狀，以降低對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的危害，減少菌株耐藥性的傳播，為獸醫(yī)臨床用藥及獸藥管理提供科學(xué)依據(jù)，為新型抗菌藥物的研制奠定理論基礎(chǔ)。采用國(guó)標(biāo)法分離鑒定大腸桿菌，肉湯微量稀釋法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，PCR法檢測(cè)氟苯尼考floR基因，膜過(guò)濾法進(jìn)行轉(zhuǎn)化接合實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：共分離大腸桿菌293株，分離率為73.3%，其中豬源157株，雞源136株；大腸桿菌對(duì)磺胺類、四環(huán)素類和氨基糖苷類藥物的耐藥性相對(duì)嚴(yán)重，對(duì)氯霉素類、氟喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺類藥物相對(duì)敏感；與歐盟EUCAST標(biāo)準(zhǔn)相比，該地區(qū)大腸桿菌的MIC分布出現(xiàn)明顯右移現(xiàn)象；80%以上的大腸桿菌均為多重耐藥菌株，以8重和9重耐藥菌株為主；氟苯尼考耐藥基因floR攜帶率為61.2%，floR基因可以在菌株間相互轉(zhuǎn)移。樣品采集地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)大腸桿菌污染嚴(yán)重，耐藥種類逐漸增多，多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因可以在菌株間相互轉(zhuǎn)移。

大腸桿菌；耐藥性；耐藥基因；floR基因

大腸桿菌是革蘭氏陰性菌的典型代表，分為致病性和非致病性兩類，其中非致病性大腸桿菌容易獲得致病性大腸桿菌的毒力因子而轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【?，引起?dòng)物和人的多種疾病[1]。雞大腸桿菌病常在雛雞階段和成年產(chǎn)蛋雞中的發(fā)病率最高，一年四季均可發(fā)生，豬大腸桿菌病包括豬白痢、豬水腫等，可導(dǎo)致豬仔大量死亡，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的威脅和重大的經(jīng)濟(jì)損失。大腸桿菌也可使人類發(fā)生急性腹瀉、膽囊炎和尿路感染等疾病，嚴(yán)重者還會(huì)造成溶血性貧血，急性腎功能衰竭，甚至死亡。由于抗生素大規(guī)模濫用，使大腸桿菌的耐藥種類逐漸增多[2-3]，并出現(xiàn)了嚴(yán)重的多重耐藥性[4-5]，導(dǎo)致大部分現(xiàn)有藥物無(wú)效[6]。由質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因可以傳遞給其他動(dòng)物和人類[7]，不但給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也帶來(lái)了食品安全和人類健康問(wèn)題。近年來(lái)，大腸桿菌對(duì)氟苯尼考的耐藥性日益嚴(yán)重，其耐藥機(jī)制的研究主要集中在floR基因上[8]，已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。如果細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性，在人類面臨細(xì)菌引起的流行性傳染病時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)找不到藥物治療的危機(jī)[9]。因此，了解大腸桿菌的耐藥現(xiàn)狀，明確其耐藥機(jī)制，不但為獸醫(yī)臨床用藥和獸藥管理提供科學(xué)依據(jù)，也可以為新藥的研制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 某養(yǎng)殖場(chǎng)豬肛門拭子200份，雞肛門拭子200份。

質(zhì)控大腸桿菌ATCC 25922，沙門標(biāo)準(zhǔn)菌株CVCC 541 中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。

麥康凱瓊脂，LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂，瓊脂糖，2×Taq PCR Master Mix，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；API 20E試劑條 北京威泰科生物技術(shù)有限公司；凍干型細(xì)菌定量藥敏MIC測(cè)試盒 天津市金章科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備 生物安全柜來(lái)自北京聯(lián)合科儀科技有限公司；自動(dòng)高壓滅菌器來(lái)自北京百萊普惠科技有限公司；生化培養(yǎng)箱來(lái)自上海一恒科技有限公司；PCR儀，凝膠成像儀，電泳儀來(lái)自北京元業(yè)伯樂科技發(fā)展有限公司；臺(tái)式離心機(jī)（Sigma1-14）北京博勵(lì)行儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集 2015年從某養(yǎng)殖場(chǎng)采集豬肛門拭子200份，雞肛門拭子200份，儲(chǔ)存于無(wú)菌運(yùn)送培養(yǎng)基中，48 h內(nèi)分離大腸桿菌。

1.3.2 大腸桿菌分離鑒定 將運(yùn)送培養(yǎng)基中的拭子接種于麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h，取粉紅色單菌落接種于麥康凱瓊脂平板純化一代，37℃培養(yǎng)48 h；再挑取粉紅色單菌落接種于LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。取營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的單菌落用API 20E試劑條進(jìn)行生化鑒定，具體操作參照說(shuō)明書。

1.3.3 藥敏實(shí)驗(yàn) 鑒定完的大腸桿菌用凍干型細(xì)菌定量藥敏測(cè)試盒對(duì)以下6大類抗生素12種藥物進(jìn)行藥敏檢測(cè)：β-內(nèi)酰胺類：氨芐西林（AM）、阿莫西林/克拉維酸（A/C）、頭孢噻呋（CF）；磺胺類：磺胺異惡唑（SZ）、復(fù)方新諾明（SXT）；四環(huán)素類：四環(huán)素（TE）、多西環(huán)素（DO）；氨基糖苷類：慶大霉素（GM）、大觀霉素（SPT）；氯霉素類：氟苯尼考（FFC）；氟喹諾酮類：恩諾沙星（ENR）、氧氟沙星（OFX）。用大腸桿菌ATCC 25922做質(zhì)控對(duì)照，具體操作參照藥敏測(cè)試盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.4 氟苯尼考耐藥基因floR檢測(cè) 位于轉(zhuǎn)座子上的氯霉素抗性基因floR可導(dǎo)致革蘭氏陰性菌對(duì)氯霉素產(chǎn)生耐藥[10]，主要對(duì)氟苯尼考產(chǎn)生耐藥性，其耐藥機(jī)制也是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。本文對(duì)藥敏實(shí)驗(yàn)中氟苯尼考耐藥的大腸桿菌進(jìn)行floR耐藥基因檢測(cè)。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取大腸桿菌基因組DNA。

從 GenBank中找到floR基因序列，用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，如表1所示。

表1 引物序列

PCR反應(yīng)體系：上下游引物各1 μ L，DNA模板5 μ L，2×Taq Master Mix 12.5 μ L，用ddH2O補(bǔ)齊至25 μ L。

PCR反應(yīng)程序：第1步，94℃預(yù)變性5 min；第2步，設(shè)置30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s；第3步，72℃延伸2 min，4℃保存。同時(shí)用水做陰性對(duì)照。

取5 μ L PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓90 V，電泳時(shí)間30 min，置于凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.3.5 floR基因轉(zhuǎn)化接合實(shí)驗(yàn) floR基因存在于大腸桿菌質(zhì)粒上，可在菌株間相互傳播，本文采用對(duì)氟苯尼考有較高耐藥表型且攜帶floR基因的大腸桿菌作為供體菌株，用對(duì)氟苯尼考不耐藥的沙門氏菌CVCC 541作為受體菌株。

接合實(shí)驗(yàn)采用膜過(guò)濾接合法進(jìn)行，供體菌和受體菌活化后均在LB培養(yǎng)液中，37℃搖菌4 h，使菌體長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期；供體菌與受體菌液以1：5混合，混合物用0.45 μm的濾膜過(guò)濾，將濾膜置于LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；然后用LB液體培養(yǎng)基沖洗濾膜上的細(xì)菌混合物至含有8 μg/mL氟苯尼考藥物的沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上37℃過(guò)夜培養(yǎng)；挑取紫色的沙門氏菌做藥敏實(shí)驗(yàn)和floR基因的PCR擴(kuò)增，看受體菌是否獲得供體菌的耐藥表型和相應(yīng)抗性基因，從而判斷抗性基因是否發(fā)生轉(zhuǎn)移。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌分離率 400份樣品共分離到大腸桿菌293株，分離率為73.3%，其中豬源157株，雞源136株，說(shuō)明此地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)大腸桿菌污染嚴(yán)重。

2.2 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 大腸桿菌耐藥表型 293株大腸桿菌對(duì)12種抗菌藥物都有不同程度的耐藥見表2。由表2可以看出，大腸桿菌對(duì)SZ耐藥率最高，占93.5%；其次為TE、SXT、DO、AM、SPT、 GM和FFC，耐藥率分別為86.4%、82.6%、82.3%、79.5%、73.0%、65.5%和50.2%；對(duì)A/C、ENR和OFX相對(duì)敏感，耐藥率分別為45.4%、38.6%和30.7%；對(duì)CF最為敏感，耐藥率僅占18.4%?？傮w耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，對(duì)磺胺類、四環(huán)素類和氨基糖苷類藥物相對(duì)嚴(yán)重，對(duì)氯霉素類、氟喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺類藥物相對(duì)敏感。293株大腸桿菌中，豬源和雞源的耐藥性也有所差異，由表3可以看出，豬源和雞源大腸桿菌對(duì)AM、SZ、TE、DO和 GM的耐藥程度趨勢(shì)相同，對(duì)SPT和FFC的耐藥性，豬源明顯高于雞源，而對(duì)A/C、CF、SXT、ENR和OFX的耐藥性，雞源卻明顯高于豬源。說(shuō)明對(duì)于不同種類的動(dòng)物，對(duì)某些抗生素的耐藥性不同，應(yīng)該區(qū)分用藥，減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

表2 大腸桿菌耐藥性

表3 豬源和雞源大腸桿菌耐藥性

圖3 氟苯尼考的MIC分布

2.2.2 MIC分布 選取在我國(guó)比較常用且耐藥性比較強(qiáng)的四環(huán)素類藥物TE（四環(huán)素）、氨基糖苷類藥物SPT（大觀霉素）和氯霉素類藥物FFC（氟苯尼考），對(duì)本文所分離的大腸桿菌的MIC分布與歐盟2015年公布的EUCAST標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，結(jié)果如圖1、2、3所示。從圖中可以看出，樣品采集地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)分離出的大腸桿菌對(duì)TE、SPT和FFC藥物的耐藥菌株大部分分布在高濃度區(qū)域，與歐盟EUCAST標(biāo)準(zhǔn)比較，這3種藥物的MIC分布均出現(xiàn)明顯右移的情況，說(shuō)明該地區(qū)對(duì)這3種藥物的耐藥性嚴(yán)重超過(guò)了歐洲國(guó)家，細(xì)菌耐藥現(xiàn)象非常嚴(yán)重，應(yīng)及時(shí)采取措施控制。

2.2.3 多重耐藥性 從上述藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，大腸桿菌的耐藥現(xiàn)象非常嚴(yán)重，其多重耐藥性結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，80%以上的大腸桿菌為多重耐藥菌株，主要以8重和9重耐藥菌株為主，最多可以耐12種抗菌藥物，占4.1%。

圖4 大腸桿菌多重耐藥性

2.3 氟苯尼考耐藥基因floR的攜帶率 293株大腸桿菌中有147株對(duì)氟苯尼考耐藥，其中有90株含有floR基因，占61.2%，說(shuō)明floR基因是導(dǎo)致氟苯尼考耐藥的重要機(jī)制，其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。部分菌株floR基因的電泳圖如圖5所示。

圖5 floR基因的PCR電泳圖，673bp

2.4 轉(zhuǎn)化接合結(jié)果 用攜帶floR基因，并對(duì)氟苯尼考有較高耐藥表型的大腸桿菌作為供體菌，用對(duì)氟苯尼考不耐藥的沙門氏菌CVCC 541作為受體菌株。通過(guò)轉(zhuǎn)化接合，受體沙門氏菌獲得了供體大腸桿菌的floR基因，并對(duì)氟苯尼考表現(xiàn)為耐藥，說(shuō)明質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因可以在不同菌株間相互轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)化前后的floR基因的PCR結(jié)果如圖6所示。

圖6 floR基因的轉(zhuǎn)化接合結(jié)果（673bp）

3 討 論

3.1 大腸桿菌分離率 本實(shí)驗(yàn)可以看出該地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)的大腸桿菌分離率較高，污染嚴(yán)重，這不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，而且給人類健康造成了威脅，存在嚴(yán)重的食品安全隱患。

3.2 大腸桿菌耐藥性 本文所分析的大腸桿菌對(duì)磺胺類和四環(huán)素類耐藥嚴(yán)重，這是由于該地區(qū)多年來(lái)長(zhǎng)期使用所導(dǎo)致，而對(duì)頭孢噻呋敏感性較好，頭孢噻呋為第3代頭孢菌素類抗生素，使用時(shí)間短，沒有在全國(guó)范圍內(nèi)廣泛使用，所以還沒有產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性，今后在使用頭孢噻呋時(shí)，應(yīng)注意適時(shí)適量，防止菌株很快對(duì)其產(chǎn)生耐藥性。大腸桿菌耐藥性結(jié)果對(duì)當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場(chǎng)的預(yù)防用藥和治療用藥具有實(shí)際指導(dǎo)與借鑒意義，在該地區(qū)應(yīng)該停止使用SZ、TE、SXT和DO這4種抗菌藥物，對(duì)SPT、 GM和FFC應(yīng)該改變藥物劑量或者與其他同類藥物交叉使用，A/C、ENR和OFX還可以繼續(xù)在該地區(qū)使用，但要避免濫用情況，對(duì)癥用藥，否則很快就會(huì)出現(xiàn)耐藥菌株而使該藥物失效。

3.3 氟苯尼考耐藥基因 floR的攜帶及轉(zhuǎn)移情況對(duì)氟苯尼考耐藥的大腸桿菌，有61.2%含有floR基因，說(shuō)明大腸桿菌對(duì)氟苯尼考產(chǎn)生耐藥性主要是由于獲得了floR耐藥基因?qū)е?，而floR基因還可以在菌株間相互轉(zhuǎn)移，在一定程度上對(duì)耐藥菌產(chǎn)生的分子機(jī)制和新藥的研制提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果可以看出,樣品采集地區(qū)大腸桿菌污染嚴(yán)重，耐藥種類逐漸增多，多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，對(duì)磺胺類和四環(huán)素類耐藥最為嚴(yán)重，對(duì)氟喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺類較為敏感。四環(huán)素、大觀霉素和氟苯尼考3種藥物的MIC分布與歐盟相比有明顯右移現(xiàn)象。floR基因是導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)氟苯尼考耐藥的重要機(jī)制，質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因可以在菌株間相互轉(zhuǎn)移。

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S828.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-01-001

2016-07-25；

2016-08-24

劉艷紅（1992-），女，山西人，碩士，主要從事微生物分子生物學(xué)的研究，E-mail:1187741673@qq.com

*通訊作者：呂淑霞，E-mail:lushuxia@hotmail.com.