胡仁建， 顧 盼， 蔡家利， 劉海軍，丁 森，張 奎， 李重陽， 陳 華，王冬梅

(1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院, 重慶 400074；2.西南大學 家蠶基因組生物學國家重點實驗室， 重慶 400074；3.重慶市公安局， 重慶 400074； 4.南京大學， 南京 210023；5.珠海聯(lián)邦制藥有限公司， 廣州 528400； 6.中國農(nóng)業(yè)大學， 北京 100193)

重慶兩株H5N1流感病毒的HA、NA基因克隆及序列分析

胡仁建1，2， 顧 盼1， 蔡家利1， 劉海軍3，丁 森4，張 奎2， 李重陽2， 陳 華5，王冬梅6

(1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院, 重慶 400074；2.西南大學 家蠶基因組生物學國家重點實驗室， 重慶 400074；3.重慶市公安局， 重慶 400074； 4.南京大學， 南京 210023；5.珠海聯(lián)邦制藥有限公司， 廣州 528400； 6.中國農(nóng)業(yè)大學， 北京 100193)

2012年，從重慶北碚區(qū)和巴南區(qū)的家禽養(yǎng)殖場死鴨和病雞體內(nèi)分離出兩株H5N1禽流感病毒，分別命名為A/duck/Chongqing/BB/H5N1和A/chicken/Chongqing/BN/H5N1，并對這兩株H5N1禽流感病毒的HA、NA和M蛋白的基因進行了克隆及序列分析，在基因和蛋白質(zhì)水平上分析其同源性。遺傳進化樹分析結(jié)果表明：這兩毒株的HA、NA和M基因不處于同一支上，親緣關(guān)系較遠；這兩毒株的HA、NA、M蛋白的基因同源性分別達95%，95%，97% ；兩毒株的HA蛋白裂解位點氨基酸序列均為RERRR-KR，符合高致病性禽流感的特征。本次分離的流感病毒的基因克隆鑒定和序列分析為禽流感的流行病學研究、疫苗研制以及防控提供重要理論依據(jù)。

禽流感病毒；H5N1；基因克?。恍蛄蟹治?；進化分析

高致病性禽流感(high pathogenic avian influenza,HPAI)是由A型流感病毒引起家禽高致病性高死亡率的疾病。該病毒分布廣泛，國際獸疫局將其劃定為A類傳染病，是世界各國檢疫和防控的重點對象[1-2]。HPAI病毒可在家禽中傳播流行，引起大規(guī)模爆發(fā)，導致世界范圍內(nèi)禽類副產(chǎn)品的嚴重下降以及禽類的大量死亡。1996年，在中國廣東省的家鵝中分離鑒定出第1株高致病性H5N1病毒(A/goose/Guangdong/1/96)[3]。該毒株被認為是H5N1病毒的祖先毒株，現(xiàn)流行的H5N1病毒多是由該原始毒株演化而來的[3-5]。自1996年以來，祖先毒株以不可預測的方式快速蔓延至亞洲、歐洲及非洲的許多國家[6]。在物種間持續(xù)的傳播流行使得H5N1病毒在不同的地理區(qū)域基因分化形成進化親緣關(guān)系較遠的各個分支。

HA和NA是流感病毒粒子表達最豐富的兩種表面抗原，它們的基因變異也是最為頻繁的[7-8]。HA 是決定病毒致病性、毒力強弱和宿主特異性等方面的關(guān)鍵因素之一，NA在變異中起次要作用[9-10]。此外，高致病力毒株的 HA 在其裂解位點附近均有多個堿性氨基酸,而低致病力毒株的HA 在其裂解位點只有一個精氨酸(R)[5]。本文對2012年從重慶發(fā)病地區(qū)病死鴨和病雞體內(nèi)中分離鑒定出2株H5N1亞型AIV進行HA和NA基因克隆和序列分析，探討2株H5N1亞型AIV的變異、進化特點、HA蛋白的裂解位點的差異，為禽流感的有效防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

病死鴨和病雞分別來自重慶市北碚區(qū)一鴨場和重慶市巴南區(qū)一雞場；SPF級雞胚購自重慶長壽區(qū)特驅(qū)有限公司；TIANamp Virus DNA/RNA Kit購于天根生化科技(北京)有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)mega公司；PrimeScript?RT reagent Kit、T19載體和JM109感受態(tài)細胞購自寶生物(大連)公司；引物由寶生物(大連)公司合成；Thermo ScientificTMPCR 儀購自Thermo Scientific公司；禽流感病毒H5N1、H7N1和H9N2標準血清以及雞新城疫標準血清由重慶理工大學藥學與生物工程學院生物制藥實驗室保存。

無菌采集死鴨、病雞的肺、脾、腎、肝、腦等病料，用液氮冷凍磨碎病料后加入無菌0.9%生理鹽水，10 000 r/min離心30 min，用0.45 μm和0.22 μm過濾取上清液。按尿囊腔法接種9日齡的SPF級雞胚，死鴨和病雞的處理病料液分別以200 μL/只接種雞胚，注射無菌生理鹽水作為空白對照。37℃孵育，每天檢查并收集24 h后死亡雞胚的尿囊液。

1.3 尿囊液的紅細胞凝集試驗和紅細胞凝集抑制試驗

按照參考文獻[11]做紅細胞凝集試驗,測定用0.5%甲醛滅活后的雞胚尿囊液的病毒血凝效價，用標準的禽流感病毒H5N1、H7N1、H9N1和新城疫病毒血清做紅細胞血凝抑制試驗。

1.4 陽性尿囊液禽流感病毒HA、NA和M基因的克隆和測序

為進一步鑒定兩分離毒株亞型，引用中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準(NY/T772—2004)中禽流感病毒RT-PCR實驗方法中的引物6對：引物M-229U/M-229L是特異性擴增M基因的，以此來確定其屬于A類禽流感[12-13]；引物H5-380U/H5-380L、 H7-501U/H7-501L 和H9-732U/H9-732L可分別擴增H5、H7和H9基因；N1和N2基因的特異性引物則分別為N1-358U/N1-358L 和 N2-377U/N2-377L。根據(jù)RNA提取試劑盒說明書，提取血清學鑒定為陽性的尿囊液的RNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板PCR擴增H5、H7、H9、N1、N2和M基因產(chǎn)物。PCR的反應體系是50 μL，包含雙蒸滅菌水37.5 μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4 μL、上下游引物各0.5 μL、PCR Buffer 5.0 μL、2.5 mmol/L的dNTPs 2.0 μL、Taq聚合酶 0.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s,52 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)30次；72 ℃再延伸6 min。同時設(shè)置陽性和陰性對照。DNA電泳鑒定PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物H5、N1、M基因分別與19-T載體連接并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞JM109中，將經(jīng) PCR鑒定為陽性克隆質(zhì)粒的送寶生物(大連)公司測序。

1.5 基因比對、進化樹的構(gòu)建和蛋白質(zhì)序列分析

將從禽類中分離兩個毒株的H5、N1、M基因的核酸序列提交至Clustal W進行多序列比對，氨基酸的殘基分析利用BioEdit 7.1.5軟件。利用NCBI對相應序列進行BLAST，分析這兩毒株之間的同源性等，并與 GenBank中其他HA基因的核酸序列進行比對，分析兩毒株與其他參考毒株的同源性。病毒的分支鑒定參考WHO/FAO H5N1 Evolution Working Group[14-15]。利用MEGA5.05軟件采用鄰接法(neighbor-joining method,NJ)構(gòu)建遺傳進化樹，以序列的同源性、地域來源、分離時間以及WHO和FAO推薦的的代表性H5N1毒株為基準。

消除方法的基本思路是將定向耦合器3端口和4端口的測量數(shù)據(jù)均等效為被測發(fā)射機端口的發(fā)射數(shù)據(jù)，然后進行對消.

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離與鑒定

接種北碚死鴨病料處理液的雞胚在36～64 h死亡，接種巴南病雞處理液的雞胚在48～ 56 h死亡，接種生理鹽水的對照組未死亡。所有死亡雞胚全身出血，接種北碚死鴨病料處理液的雞胚比接種巴南病雞處理液的雞胚出血更嚴重，所有死亡雞胚的體型小于空白對照雞胚，死亡雞胚尿囊液都清晰紅色透明，空白雞胚尿囊液無色透明。

紅細胞凝集試驗顯示：北碚死鴨病料處理液的雞胚和接種巴南病雞處理液的雞胚的尿囊液的血凝效價分別為1∶128和1∶32。紅細胞凝集抑制試驗顯示：H5N1和H7N1標準血清均可抑制兩毒株，其血凝抑制效價均為1∶32和1∶8。標準的禽流感病毒H9N1病毒血清和新城疫病毒血清均不能抑制兩株病毒。

如圖1(a)所示： RT-PCR擴增出與禽流感病毒H5(380bp)、N1(358bp)基因大小一致的PCR產(chǎn)物片段，陰性對照無對應的產(chǎn)物，說明兩株禽流感病毒的亞型為H5N1；如圖1(b)所示： RT-PCR擴增出與禽流感病毒M(229bp)基因大小一致的PCR產(chǎn)物片段，陰性對照無對應的產(chǎn)物，提示兩毒株均為A類禽流感病毒。分別將兩毒株命名為A/duck/Chongqing/BB/2012(簡稱北碚株) 和A/chicken/Chongqing/ BN/2012(簡稱巴南株)。

M，DL2000Marker；1，2.北碚株 H5 PCR產(chǎn)物； 3，4.巴南株 H5 PCR產(chǎn)物； 5.H5 PCR陰性對照； 6，-7.北碚株 N1 PCR產(chǎn)物； 8，9.巴南株 N1 PCR產(chǎn)物；10.N1 PCR陰性對照。

(a)H5和N1基因 PCR產(chǎn)物鑒定

M， DL2000Marker；1，M基因陰性對照；2，3，4.北碚株 M PCR產(chǎn)物；5，6，7.巴南株 M PCR產(chǎn)物。

(b)M基因 PCR產(chǎn)物鑒定

圖1 PCR產(chǎn)物鑒定

Fig.1 PCR product identification

2.2 北碚株和巴南株的HA及NA基因的核酸序列比對

將北碚株和巴南株的HA、NA和M基因的核酸序列共6個上傳至NCBI，獲得序列號為：BankIt1936040 Seq1 KX544798,BankIt1936175 Seq2 KX544799,BankIt1936181 Seq3 KX544800,BankIt1936183 Seq4 KX544801,BankIt1936185 Seq5 KX544802,BankIt1936188 Seq6 KX544803。兩毒株核酸序列比對顯示：北碚株與巴南株之間HA和NA基因均存在17個堿基的差異，且它們的HA和NA基因的核酸同源性均為95%；此外，它們的M基因有7個堿基不同，同源性達97%。

2.3 遺傳進化樹分析

為了更好地理解兩分離毒株的進化歷史，構(gòu)建了HA、NA和M基因的遺傳進化樹。如圖2(a)所示，可見北碚株和巴南株的HA基因分別屬于clade2.3.2.1及clade2.3.4.2。從HA基因進化樹上可以看出，北碚株的HA核酸序列與A/duck/Hunan/8/2008的同源性最高，達98%，而巴南株的HA核酸序列與A/environment/Guizhou/4/2009有99%的同源性。發(fā)現(xiàn)巴南株和北碚株與A/bar-headed goose/Qinghai/3/2005(H5N1)和A/bar-headed goose/Tibet/8/2006(H5N1)在同一大支，推測分離的兩株H5N1病毒株可能來源于后兩株。這可能是H5N1禽流感病毒進出南方的佐證，病毒很有可能是通過野鳥的遷徙傳播的。

如圖2(b)所示：北碚株和巴南株的NA基因不在同一個分支上，親緣關(guān)系較遠。北碚株與代表性的參考毒株A/duck/Hunan/8/2008和A/Hubei/1/2010處于同一支上。北碚株與巴南株的NA核酸序列分別與A/wild duck/Fujian/1/2011 和A/environment/Guizhou/4/2009均有99%的同源性。

如圖2(c)所示：北碚株與巴南株的M核酸序列分別與A/duck/Wenzhou/YHQL22 /2014(H5N6)和A/environment/Guizhou /4/2009毒株的同源性最高，均達99%。

2.4 蛋白變異與裂解位點分析

如表1所示：在HA蛋白比對中，兩株毒株之間存在兩個氨基酸的替換，它們HA蛋白的同源性達98%。兩毒株的H5蛋白裂解位點一致，均為RRRKR，為5個連續(xù)的堿性氨基酸序列，符合高致病性禽流感的特征，但與祖先毒株A/goose/Guangdong/1/96 相比，均缺失一個堿性氨基酸殘基賴氨酸(K)。與祖先毒株A/goose/Guangdong/1/96相比，兩毒株均存在抗原漂移現(xiàn)象：HA蛋白中，巴南株為298M-I、326R-K、336T-S和338Q-L，北碚株為293K-R、326R-K、336T-S和338Q-L；NA蛋白中，巴南株有259E-K和289T-I兩個氨基酸突變，北碚株有232A-T、258M-I和289T-I三個氨基酸突變；M蛋白中，兩毒株均有15V-I和27R-K兩個氨基酸突變(見表2)。兩毒株的M蛋白氨基酸序列一致，均與A/chicken/Hubei/wn/2003毒株的M蛋白有最高的同源性(見表2)。

圖2 基因進化樹 Fig.2 Phylogenetic trees from neighbor-joining analyses表1 分離株與中國其他毒株HA蛋白氨基酸比對及裂解位點分析Table 1 HA amino acid subsititution comparison between studied strains and other Chinese isolates.

H5蛋白氨基酸序號是根據(jù)A/goose/Guangdong/1/1996。

表2 分離株與中國其他毒株NA、M蛋白氨基酸比對Table 2 Deduced amino acid sequences of NA and M1 in the BB and BN strains relative to some genetically related strains

NA、M蛋白氨基酸序號是根據(jù)A/goose/Guangdong/1/1996。

3 討論

1996年H5N1亞型禽流感病毒首次在中國廣東省病鵝中檢測到，分為無致病性和高致病性兩種，自H5N1首次被鑒定后，在中國20多個省的多個農(nóng)場又出現(xiàn)H5N1大流行[1-2,16]。高致病性H5N1病毒clade2.3.2首次在2005年從中國以及越南的鴨、鵝中鑒定得到[17- 18]。從2006年以來，在香港從野鳥中分離的H5N1病毒中，clade2.3.2和clade2.3.4占據(jù)主導地位[19-0]。FAO-OIE-WHO表示clade2.3.2.1在東南亞的流行是目前H5N1頻繁爆發(fā)的主要原因，目前在印度、老撾、越南、尼泊爾、中國、俄羅斯、日本和孟加拉均有H5N1clade2.3.2.1病毒株的相關(guān)報道[13,21-24]。此外，從2005年以來，由H5N1clade2.3.4病毒株的H5基因變異的新型毒株在中國以及其他地區(qū)傳播流行[25]。

在本試驗中，從重慶市北碚區(qū)某鴨場和巴南區(qū)某雞場分離出兩種病毒株。血清學研究結(jié)果表明：H5及H7標準血清可抑制兩種病毒。通過RT-PCR進行進一步鑒定，M基因RT-PCR結(jié)果表明兩種病毒均屬于禽流感A類病毒，并且均可擴增出H5和N1的特異性條帶，將其命名為A/duck/Chongqing/BB/2012(北碚株) 和A/chicken/Chongqing/BN/2012(巴南株)。進化分析結(jié)果表明：北碚株和巴南株的HA基因分別屬于clade2.3.2.1及clade2.3.4.2。通過進化樹分析發(fā)現(xiàn)：巴南株的HA，NA，M基因均與A/environment/Guizhou /4/2009有較高的同源性，而北碚株則與A/duck/Hunan/8/2008 和A/Hubei/1/2010接近。此外，兩毒株的H5蛋白氨基酸裂解位點序列均為RERRR-KR，符合高致病禽流感的特征。裂解位點缺失一個K，可能對病毒毒力有一定影響。M.S.Lee等[6]發(fā)現(xiàn)：含RERRR-KR位點的Dk/CHN/E319-2/03病毒株對小鼠進行攻毒試驗時，其致病性實質(zhì)上是弱于從1997年到2006年對人致死的案例中分離得到的H5N1病毒(RERRRKKR)。從這一點看，這可能也是這兩株病毒株僅引起小范圍流行而非大規(guī)模爆發(fā)的原因。北碚株在發(fā)病時流感癥狀典型嚴重，在本鴨場傳播速度很快，抗病毒、抗菌治療和再次注射禽流感疫苗和新城疫疫苗無效，在7～14天的短時間內(nèi)所有鴨子全部死亡，造成了巨大的經(jīng)濟損失；而巴南株在雞場發(fā)病時流感癥狀不典型，抗病毒、抗菌治療和再次注射禽流感疫苗和新城疫疫苗有效控制了病情，大部分雞恢復健康，死亡的雞數(shù)目較少。從以上臨床癥狀反映出北碚株的毒力大于巴南株，從進化樹結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，北碚株的H5、N1和M基因均比巴南株進化的快，提示抗原漂移在其中起到了重要作用。但由于未對H5、N1和M基因全長進行測序，北碚株及巴南株毒力差異的原因仍不是完全清楚。

本研究全面分析了中國西南的中心——重慶爆發(fā)的兩株H5N1禽流感病毒株——A/duck/Chongqing/BB/2012和A/chicken/Chongqing/BN/2012，探討了這兩株毒株的變異及進化特征，在一定程度上為H5N1禽流感在中國南方的進化提供參考信息。筆者推測：H5N1的clade2.3.2和clade2.3.4這兩支可能仍在中國南方流行并占據(jù)主導地位，這也是人類健康的一大隱患。另一方面，我國從2004年開始通過疫苗接種的手段預防H5N1禽流感病毒[26-,27]，盡管這一手段有效降低了H5N1在禽類中的發(fā)病率并顯著減少人感染的案例數(shù)，但是，由于禽類基數(shù)的龐大，難以做到對每只野鳥都進行免疫，H5N1型禽流感仍以減緩的頻率在中國南方持續(xù)爆發(fā)[26]。因此，應該清楚地認識到對H5N1在禽類中的持續(xù)監(jiān)測以及有效的控制手段的不斷更新是迫切需要的。此外，由于H5N1變異株的不斷出現(xiàn)及跨區(qū)域的持續(xù)傳播，區(qū)域性的有效防控措施必須擺在重要、突出的位置上[10]。而只有整合實時的病毒學信息、通過快速診斷方法獲取的基因信息以及配套的嚴格控制質(zhì)量的疫苗產(chǎn)品，才能真正做到系統(tǒng)地有效防控H5N1的發(fā)生及流行。本實驗中A/duck/Chongqing/BB/H5N1(2012)和 A/chicken/Chongqing/BN/H5N1(2012)兩毒株的分離與鑒定，HA、NA和M基因的克隆與序列分析，為禽流感病毒H5N1的流行病學研究(包括變異分析、進化分析)和疫苗的研制提供更多的信息，對流感的防控具有重要意義。

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(責任編輯 劉 舸)

HA and NA Gene Clone and Sequence Analysis of Two H5N1 Virus Isolates from Chongqing

HU Ren-jian1，2, GU Pan1, CAI Jia-li1, LIU Hai-jun3, DING Sen4,ZHANG Kui2, LI Chong-yang2, CHEN Hua5, WANG Dong-mei6

(1.College of Pharmacy and Biological Engineering, Chongqing University of Technology,Chongqing 400074, China; 2.State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology,Southwestern University, Chongqing 400074, China; 3.Chongqing City Public Security Bureau, Chongqing 400082, China; 4.Nanjing University, Nanjing 210023, China;5. Zhuhai United Laboratories Co. Ltd.,Guangzhou 528400, China;6.China Agricultural University, Beijing 100193, China)

Avian influenza (AI), a virus subtype H5N1 virus is a highly pathogenic avian influenza (HPAI), which is panzootic in poultry, then continues to spread and pose a major challenge to animal and human health. In 2012, two outbreaks of HPAI virus occurred and we isolated two H5N1 virus strains from two poultry farms in the Chongqing Beibei District and Banan District, named A/duck/Chongqing/BB/2012 and A/chicken/Chongqing/BN/2012, respectively. In this study, the hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA) and matrix protein (M) genes of these two strains were cloned and sequenced, and then the homogeneity and the heterogeneity were analyzed at the genetic and proteinic levels. The results shows that the homogeneity of the HA, NA and M genes was 95%, 95% and 97%, respectively. The phylogenetic analyses of HA, NA and M genes showed that A/duck/Chongqing/BB/2012 and A/chicken/Chongqing/BN/2012 were distant relatives. However, both of the two strains have the same HA gene proteolytic cleavage sites, RERRR-KR, which accorded with the molecular characteristic of high pathogenic AIV. These results could provide more information for the analysis of the sequence of avian influenza virus H5N1, including variation analysis, evolutionary analysis, as well as the development of vaccine.Key words: Avian influenza virus; H5N1 subtype; gene clone; sequence analysis; phylogenic analysis

2016-10-19

重慶市科技攻關(guān)計劃項目(cstc2012gg-yyjs80014)；重慶市科技人才培養(yǎng)計劃項目(cstc2013kjrc-1jrcpy80001)

胡仁建(1968—)，女，重慶人，博士研究生，高級實驗師，主要從事微生物與生化藥學研究，E-mail:hrj@cqut.edu.cn。

胡仁建， 顧盼， 蔡家利， 等.重慶兩株H5N1流感病毒的HA、NA基因克隆及序列分析[J].重慶理工大學學報(自然科學)，2017(1):67-74.

format：HU Ren-jian, GU Pan, CAI Jia-li, LIU Hai-jun，et al.HA and NA Gene Clone and Sequence Analysis of Two H5N1 Virus Isolates from Chongqing[J].Journal of Chongqing University of Technology(Natural Science)，2017(1):67-74.

10.3969/j.issn.1674-8425(z).2017.01.011

S855.3

A

1674-8425(2017)01-0067-08