周嘉聰, 劉小飛, 鄭 永, 紀宇皝, 李先鋒, 徐鵬程, 陳岳民,*,楊玉盛

1 福建師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院,福州 350007 2 福建師范大學(xué)濕潤亞熱帶山地生態(tài)國家重點實驗室培育基地,福州 350007

氮沉降對中亞熱帶米櫧天然林微生物生物量及酶活性的影響

周嘉聰1,2, 劉小飛1,2, 鄭 永1,2, 紀宇皝1,2, 李先鋒1,2, 徐鵬程1,2, 陳岳民1,2,*,楊玉盛1,2

1 福建師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院,福州 350007 2 福建師范大學(xué)濕潤亞熱帶山地生態(tài)國家重點實驗室培育基地,福州 350007

氮沉降對土壤微生物的擾動可能會影響土壤的養(yǎng)分循環(huán),然而關(guān)于中亞熱帶天然林土壤微生物及酶活性對氮沉降的響應(yīng)鮮有報道。通過3 a的氮沉降模擬實驗,研究中亞熱帶米櫧天然林土壤的理化性質(zhì)、土壤微生物量及土壤酶活性的響應(yīng)。結(jié)果表明：氮沉降并未引起土壤的有機碳和總氮顯著性變化；高氮(80 kg N hm-2a-1)處理下,土壤pH下降,出現(xiàn)酸化現(xiàn)象；低氮(40 kg N hm-2a-1)處理促進淋溶層(A 層)中土壤纖維素分解酶(β-葡萄糖苷酶和纖維素水解酶)和木質(zhì)素分解酶(多酚氧化酶和過氧化物酶)活性升高,同時促進土壤微生物生物量碳、氮的積累。冗余分析(RDA)表示,可溶性有機碳(DOC)是驅(qū)動A層土壤酶活性的重要環(huán)境因子；而在淀積層(B層),這4種酶活性并未發(fā)生顯著性差異。施氮處理后,A、B層中土壤的酸性磷酸酶活性增加(P<0.05)。研究表明：低水平氮沉降增加了土壤微生物生物量碳氮含量以及土壤有機碳分解相關(guān)酶活性,從而加速了土壤碳周轉(zhuǎn)；這為未來氮沉降增長背景下,探索中亞熱帶天然林土壤碳源匯問題提供了依據(jù)。

氮沉降；微生物生物量；酶活性；米櫧天然林

由于化石燃料與農(nóng)業(yè)化肥的使用,使得大量的活性N進入大氣[1],與工業(yè)革命初期相比,其氮沉降量增長了近2倍,預(yù)計到2050年,許多地區(qū)氮沉降量會再翻一番[2]。當前,我國繼歐洲,美國之后成為世界三大高氮區(qū)之一,尤其在工業(yè)化和農(nóng)業(yè)集約化程度高的華北、東南和西南地區(qū)[3]。土壤微生物是土壤有機質(zhì)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)的動力,土壤酶直接參與土壤生態(tài)系統(tǒng)的C、N、P等許多重要的生態(tài)過程。因此,氮沉降背景下,可能首先影響土壤微生物的活性及其反饋方式,進而影響生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能。

當前,氮沉降的研究主要開展于歐洲與北美的北方森林與溫帶森林,對于熱帶與亞熱帶的研究較少[4],由于熱帶與亞熱帶的養(yǎng)分循環(huán)較快,對氮沉降的響應(yīng)可能更加劇烈。當前溫帶森林關(guān)于酶活性的研究結(jié)果取得一定進展：施氮促進水解酶的活性,但是氧化酶則表現(xiàn)出促進、無影響或抑制多種結(jié)果[5- 8]。Treseder和Vitousek[9]研究表明土壤養(yǎng)分有效性的不同可能是各地研究結(jié)果差異的主要原因。而對于氮限制的北方森林和溫帶森林,提高土壤氮的有效性將顯得至關(guān)重要。許多研究表明,氮的有效性將會影響酶活性,進而改變凋落物及土壤有機質(zhì)的分解速率[10- 11]。然而,相比于溫帶森林,亞熱帶森林土壤的有效氮相對富集[12]。持續(xù)氮沉降,可能會造成土壤氮飽和現(xiàn)象而產(chǎn)生抑制土壤微生物活性的現(xiàn)象。并且,磷限制問題可能在亞熱帶地區(qū)更加突出,其限制作用可能隨著氮的添加而加劇[13]。因此,土壤微生物酶活性對氮沉降的響應(yīng)結(jié)果及機制可能不同于溫帶。

我國中亞熱帶地區(qū),由于其雨水充沛,森林群落種類豐富,是全球同緯度地帶上的“綠洲”,有著旺盛的能量轉(zhuǎn)化和物質(zhì)循環(huán)的能力,以及極強的生物生產(chǎn)力與生態(tài)效應(yīng),是全球碳循環(huán)重要的組成部分[14]。氮沉降對土壤微生物的擾動必將會影響中亞熱帶土壤的養(yǎng)分循環(huán),然而關(guān)于中亞熱帶天然林土壤微生物對氮沉降的響應(yīng)鮮有報道。因此,本試驗以米櫧天然林為樣地,探究土壤微生物量和土壤酶活性對長期氮沉降的響應(yīng)情況,為氮沉降背景下中亞熱帶天然林的土壤養(yǎng)分循環(huán)的響應(yīng)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究地位于福建省三明格氏栲自然保護區(qū)(26°11′N,117°28′E)內(nèi),樣地海拔為315 m,年均氣溫19.4℃,年均降雨量1700 mm(主要集中在3—8月份),年均蒸發(fā)量1585 mm,相對濕度79%,屬于中亞熱帶季風氣候,土壤為黑云母花崗巖發(fā)育的紅壤。群落植物種類豐富且分層明顯。其中喬木主要有米櫧(Castanopsiscarlesii)、木荷(Schimasuperba)馬尾松(Pinusmassoniana)、虎皮楠(Daphnipnyllumoldhami)等,且優(yōu)勢種為米櫧。

1.2 試驗設(shè)計

2012年11月,在米櫧天然林內(nèi)選取坡面平坦且一致的地段設(shè)置氮沉降長期試驗樣地,包括對照(CT)、低氮(LN)和高氮(HN)3種施氮處理,每個處理4個重復(fù),共設(shè)置了12塊大小為10 m×10 m的樣地,各樣地間相隔在10 m左右。

氮沉降處理：在12塊樣地內(nèi),以三明地區(qū)年平均氮沉降量(36.2 kg hm-2a-1)為參考值,設(shè)置CT(0 kg hm-2a-1)、LN(40 kg hm-2a-1)和HN(80 kg hm-2a-1),施氮采用NH4NO3(分析純),溶于20 L去離子水中,每月月初以溶液的形式在樣方內(nèi)均勻噴灑,全年分12次模擬氮沉降。對照處理噴灑等量去離子水以減少因外加水對生物地球化學(xué)循環(huán)的影響。

1.3 土壤樣品采集

2016年1月,在12個樣方內(nèi)按照“S”型隨機設(shè)置5個取樣點,去除表面凋落物,按土壤的發(fā)生層劃分為淋溶層(A層),取土深度約為8 cm；淀積層(B層),取土深度約為8—20 cm層,用土鉆鉆取。將采集的土壤迅速帶回實驗室,迅速用冰塊冷藏帶回實驗室,去除可見根系等動植物殘體,一部分樣品置于4℃冰箱中保存,用于微生物生物量、土壤酶活性的測定；另一部分土壤室溫風干保存,用于測定土壤有機碳等基本理化指標。

1.4 測定指標及方法

微生物量碳、氮采用氯仿熏蒸-硫酸鉀浸提法[17],用總有機碳分析儀(TOC-VCPH/CPN,Shimadzu,日本)測定提取液中有機碳含量,用連續(xù)流動分析儀(Skalar san++,Skalar,荷蘭)測定總氮含量。土壤微生物磷采用氯仿熏蒸-NaHCO3浸提法[18],用連續(xù)流動分析儀測定磷酸根含量。土壤微生物量碳計算公式：BC=ΔEC/kC,式中ΔEC為熏蒸與未熏蒸土壤有機碳含量的差值,kC為轉(zhuǎn)換系數(shù),取值0.38。土壤微生物量氮計算公式：BN=ΔEN/kN,式中ΔEN為熏蒸與未熏蒸土壤有機氮含量的差值,kN為轉(zhuǎn)換系數(shù),取值0.45；土壤微生物量磷計算公式為：BP=ΔEP/kP,式中ΔEP為熏蒸與未熏蒸土壤磷含量的差值,轉(zhuǎn)換系數(shù)kP取值0.4。

微生物熵按照Anderson等[19]的方法計算,即微生物量碳(MBC)與有機碳(SOC)的比值。

土壤酶活性參照Saiya-Cork和Sinsabaugh[7]的方法提取和培養(yǎng)土壤中6種與碳、氮、磷循環(huán)相關(guān)的水解酶和氧化酶。方法如下：取1 g新鮮土壤,用125 mL 50 mmol/L的醋酸鹽緩沖液(pH=5)提取,用磁力攪拌器攪拌5 min使其均質(zhì)化,用移液器取200 μL 移于96孔微孔板。

用傘形酮(MUB)作為底物標示水解酶活性,用L-二羥苯丙氨酸(DOPA)為底物標示氧化酶活性。微平板置于暗環(huán)境下經(jīng)過20℃恒溫培養(yǎng)后,用多功能酶標儀(SpectraMax M5,Molecular Devices,美國)測定其熒光度(水解酶)或吸光度(氧化酶)。6種土壤酶的名稱、縮寫、類型及所用標定底物見表1。各種酶都通過預(yù)實驗確定獲得最大酶活性所需要的底物濃度和培養(yǎng)時間。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2013和SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD進行顯著性檢驗；采用Canoco Software 5.0軟件,以6種酶活性為響應(yīng)變量進行主成分分析(PCA)；以6種酶活性為響應(yīng)變量,同時以土壤基本理化性質(zhì)及微生物生物量為解釋變量做冗余分析(RDA)；繪圖由Origin 9.0軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 土壤基本理化性質(zhì)

表2 氮沉降對土壤理化性質(zhì)的影響

表中數(shù)值為平均值±標準差,不同小寫字母表示同一土層,不同處理間差異顯著(P< 0.05)

2.2 土壤微生物量

如表3,低量氮沉降(LN)提高了A層和B層土壤的MBC和MBN含量。然而,施氮后A層的土壤的MBP顯著減少,其數(shù)量關(guān)系為CT > LN > HN(P<0.05)。

表3 氮沉降對土壤微生物量碳氮磷的影響

表中數(shù)值為平均值±標準差,不同小寫字母表示同一土層,不同處理間差異顯著(P< 0.05)

2.3 土壤微生物熵

圖1 氮沉降對不同土層微生物熵的影響 Fig.1 Effects of nitrogen deposition on microbial quotient 圖中誤差線為重復(fù)間標準誤,不同小寫字母表示同一土層,不同處理間差異顯著(P<0.05)

如圖1,A層的微生物熵對于施氮的響應(yīng)均無顯著性差異。LN提高了B層土壤的微生物熵,其微生物熵值顯著大于CT(P<0.05)。

2.4 土壤酶活性

如表4,LN和HN處理均明顯提高了A層土壤中β-葡萄糖苷酶(βG)活性,但對B層中βG無顯著影響。LN處理后,纖維素水解酶(CBH)活性顯著高于HN與CT(P<0.05),分別是HN與CT的2.26倍與2.84倍。LN和HN處理分別顯著提高了A層土壤中多酚氧化酶(PHO)和過氧化物酶(PEO)的活性,但兩種酶在B層土壤中并未發(fā)生明顯變化(P>0.05,表4)。在A層土壤中,LN顯著提高β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性(P<0.05),而在B層土壤中則顯著降低了NAG活性(P<0.05)。LN和HN顯著提高各土層酸性磷酸酶(ACP)活性 (P<0.05)。

表4 氮沉降對土壤酶活性的影響

表中數(shù)值為平均值±標準差,不同小寫字母表示同一土層,不同處理間差異顯著(P< 0.05)

2.5 土壤酶活性變化的PCA和RDA結(jié)果

以土壤A層6種酶活性數(shù)據(jù)作為響應(yīng)變量,進行PCA分析,CT、LN、HN都按照一定的規(guī)律進行了很好的聚類(圖2a),說明施氮處理后顯著的影響了A層土壤的酶活性變化。以A層土壤酶活性為響應(yīng)變量,以A層土壤的理化性質(zhì)為解釋變量進行RDA分析(圖2b),其中選擇了貢獻值靠前的4個理化性質(zhì)作為解釋變量,其第一軸解釋了變量的59.82%,第二軸解釋了6.50%,且DOC與MBP分別解釋了土壤酶活性變異的39.6%和20.0%(P<0.05)。其中MBP、pH與第一軸呈正相關(guān),DOC、DON與第一軸呈負相關(guān)。

B層土壤中的HN與CT表現(xiàn)出一定的差異,而LN則處于HN和CT的過渡(圖2c)。圖2d表明,兩軸共同解釋了土壤酶活性變異的54.99%,而MBN、DON、DOC是解釋度最高的3個環(huán)境因子,其中MBN解釋了B層土壤酶活性變異的28.9%,且3個環(huán)境因子都與第一軸呈正相關(guān)。MBN、DON與NAG均有很強負相關(guān)性。

圖2 氮沉降對土壤酶活性影響的主成分分析和冗余分析Fig.2 Correlations of soil enzyme activities to soil properties as determined by principle component analysis (PCA) and redundancy analysis (RDA)

3 討論

3.1 土壤微生物生物量、微生物熵對氮沉降的響應(yīng)

MBP反映著土壤中有機-無機磷素的轉(zhuǎn)化過程。本地區(qū)土壤屬于酸性紅壤,含有大量的鐵和鋁氧化物,對土壤中的P具有很強的固定能力[24],造成P的有效性較低。而氮沉降加快了土壤的養(yǎng)分循環(huán)[25],釋放出一定的磷被植物吸收,進而減少了土壤中微生物可利用的磷。

土壤微生物量碳MBC與土壤總有機碳SOC的比值被稱為微生物熵,是一個評價土壤有機碳增加或缺失的指標[26]。然而施氮后,A層土壤各處理間并未產(chǎn)生顯著性差異。張帆等[27]認為,由于冬季的溫度較低,微生物熵敏感性下降。因此,A層土壤中各處理間表現(xiàn)出的差異不顯著,可能與微生物熵的季節(jié)性動態(tài)有關(guān)。而在B層土壤中,LN顯著提高了微生物熵,LN處理下,微生物利用SOC的能力增強,與LN提高B層土壤MBC、MBN的結(jié)論一致。

3.2 土壤酶活性對氮沉降的響應(yīng)

土壤酶是土壤生物化學(xué)過程的積極參與者,在生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動過程中扮演著重要的角色,主要來源于土壤微生物、根系的分泌物及動植物殘體分解釋放的過程[28]。

底物以碳為主的多糖(纖維素)、芳香族化合物(木質(zhì)素)和脂肪族化合物[29],其分解酶主要為纖維素水解酶類(βG和CBH)和木質(zhì)素分解酶類(PHO和PEO)。

LN處理顯著提高了纖維素分解酶的活性。Fog[30]研究中發(fā)現(xiàn)高水平的無機氮添加顯著提高纖維素含量高的凋落物分解速率。而Sinsabaugh等[31]在溫帶森林的研究中發(fā)現(xiàn),纖維素酶的活性隨著氮素可利用性的提高而增強。本研究中HN處理中纖維素酶活性雖然提高,但與CT相比并不顯著,,這可能是因為本試驗中HN可能已經(jīng)達到了土壤的氮飽和點,而過量的N對纖維素分解酶產(chǎn)生抑制作用,從而減弱了纖維素等有機質(zhì)的分解,這與HN處理下MBC的含量較低的結(jié)論具有一致性。而在溫帶森林氮的有效性遠低于亞熱帶森林,氮沉降氮促進纖維素酶活性的幅度高于本試驗樣地。

底物以氮為主的氨基化合物、縮氨酸和非縮氨基化合物[29],分解酶β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,NAG。在B層土壤中,施氮處理抑制了土壤NAG的活性。當土壤中N的有效性低時,微生物需要以消耗自身生長及代謝為代價而生產(chǎn)NAG,以便將土壤中的幾丁質(zhì)分解成可利用的無機氮[35]。然而,施氮提高了土壤中的氮有效性,滿足了微生物的生長需求,因此并不需要產(chǎn)生過多NAG而造成酶活性相對降低。

磷主要存在于單酯和多脂中[36],分解酶主要有酸性磷酸酶,ACP。施氮促進土壤中ACP的活性。這與大多數(shù)的研究結(jié)果一致[5,7,37]。孫翠玲等[38]研究則表明,ACP活性與土壤中全氮和堿解氮的含量呈正相關(guān)。土壤氮增加,增加了微生物對磷素的需求,因此促進了ACP的活性,進而水解更多有機磷被吸收利用。

3.3 酶活性變化的關(guān)鍵驅(qū)動因子

DOC是影響A層土壤酶活性變化的主要環(huán)境因子,并且與纖維素水解酶、木質(zhì)素分解酶及酸性磷酸酶的活性具有正相關(guān)關(guān)系(圖2b)。LN處理下,土壤DOC顯著提高,這與Pregitzer等[39]的研究結(jié)果一致。而DOC作為微生物最主要的能源[40],反映著土壤中微生物的活性變化[41]。微生物活性提高則需要從土壤中攝取更多的營養(yǎng)元素供其生長。因此,本研究表明,氮沉降背景下,DOC驅(qū)動A層土壤纖維素水解酶類、木質(zhì)素分解酶類及酸性磷酸酶活性,促進微生物更好地利用土壤中碳、磷元素。然而由于礦質(zhì)土壤對DOC的吸附作用與土層的滯留性[42],造成B層土壤的DOC含量相對較低,并且其含量不受施氮影響。與A層驅(qū)動因子不同,MBN和MBC是驅(qū)動B層土壤酶活性的主要因子(圖2d),這與Zhou等[43]的研究結(jié)果一致。Schimel和Weintraub[33]建立的一個關(guān)于“微生物-酶活性”的模型中表明,土壤微生物量在土壤的C、N周轉(zhuǎn)中起著關(guān)鍵的作用。Allison等[44]也強調(diào)氣候變化下,土壤微生物生理及生物量在碳氮循環(huán)中的重要性。因此,在養(yǎng)分有效性較低的B層,微生物量是驅(qū)動酶活性的關(guān)鍵因子。

4 結(jié)論

經(jīng)過3a的氮沉降模擬實驗,LN處理促進了A層土壤纖維素水解酶、木質(zhì)素分解酶及酸性磷酸酶活性。RDA表示DOC是驅(qū)動A層土壤酶活性的主要環(huán)境因子,LN提高了A層土壤DOC含量,促進了土壤微生物生物量。同時提高纖維素水解酶和木質(zhì)素分解酶活性。A層土壤的碳含量占土壤碳庫的比例較高,施氮處理后促進了土壤的碳循環(huán),因此在氮沉降背景下,中亞熱帶米櫧天然林土壤作為碳源匯的問題值得注意。由于模擬氮沉降的時間長短對土壤微生物群落組成也有一定的影響,因此本試驗樣區(qū)氮沉降模擬試驗還需持續(xù)進行,以便更好地探究土壤微生物量及酶活性對氮沉降的長期響應(yīng),為長期氮沉降對森林生態(tài)系統(tǒng)土壤微生物的影響以及探索中亞熱帶天然林土壤碳源匯問題提供科學(xué)依據(jù)。

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Effects of nitrogen deposition on soil microbial biomass and enzyme activities inCastanopsiscarlesiinatural forests in subtropical regions

ZHOU Jiacong1,2,LIU Xiaofei1,2,ZHENG Yong1,2,JI Yuhuang1,2,LI Xianfeng1,2,XU Pengcheng1,2,CHEN Yuemin1,2,*，YANG Yusheng1,2

1SchoolofGeographicalSciences,FujianNormalUniversity,Fuzhou350007,China2StateKeyLaboratoryofSubtropicalMountainEcology(FoundedbyMinistryofScienceandTechnologyandFujianProvince),FujianNormalUniversity,Fuzhou350007,China

Anthropogenic nitrogen (N) enrichment is a concern worldwide, as it affects almost every aspect of ecosystem function and composition, particularly soil microbial communities that control soil organic matter (SOC) and nutrient turnover. Although many long-term nitrogen addition experiments have been conducted, there are still no conclusions about how microorganisms respond to nitrogen deposition, especially in mid-subtropical natural forests. Assays for soil microbial biomass and enzyme activity have become a common methodology for studying soil function in response to global environmental changes and disturbances. Between 2012 and 2015, we stimulated nitrogen deposition in aCastanopsiscarlesiinatural forest in Sanming Fujian Province in subtropical China. Soils were collected from four control plots (CT), four low-nitrogen addition plots (LN), and four high-nitrogen addition plots (HN). We studied the physicochemical properties of the soil; soil microbial C, N, and P biomasses; and potential activity of six enzymes in response to 3 years of nitrogen deposition. The results showed that nitrogen deposition had little impact on SOC and total nitrogen content. The HN treatment significantly decreased the pH and acidified the soil. Cellulose hydrolysis enzymes (β-glucosidase (βG) and cellobiohydrolase (CBH)) and lignin oxidases enzymes (phenol oxidase (PHO) and peroxidase (PEO)) showed a significant response to the LN treatment in the A horizon. Similarly, the LN treatment promoted microbial biomass carbon (MBC) and nitrogen (MBN) in the A horizon. Redundancy analysis (RDA) showed that dissolved organic carbon (DOC) greatly accounted for the variation in soil enzyme activities in the A horizon. However, it did not reveal any significant differences in cellulose hydrolysis and lignin oxidases in the B horizon. Moreover, nitrogen deposition promoted acid phosphatase activities in the two soil horizons. In summary, the LN treatment accelerated soil carbon turnover, promoting soil carbon mineralization. This may provide a theoretical basis for assessing whether mid-subtropical natural forest soil will become a carbon sink or source in an N-deposition background.

nitrogen deposition; microbial biomass; enzyme activities;Castanopsiscarlesiinatural forest

國家自然科學(xué)基金重點資助項目(31130013); 國家“973”計劃資助項目(2014CB954003)

2016- 08- 18;

2016- 11- 04

10.5846/stxb201608181684

*通訊作者Corresponding author.E-mail: ymchen@fjnu.edu.cn

周嘉聰, 劉小飛, 鄭永, 紀宇皝, 李先鋒, 徐鵬程, 陳岳民,楊玉盛.氮沉降對中亞熱帶米櫧天然林微生物生物量及酶活性的影響.生態(tài)學(xué)報,2017,37(1):127- 135.

Zhou J C,Liu X F,Zheng Y,Ji Y H,Li X F,Xu P C,Chen Y M,Yang Y S.Effects of nitrogen deposition on soil microbial biomass and enzyme activities inCastanopsiscarlesiinatural forests in subtropical regions.Acta Ecologica Sinica,2017,37(1):127- 135.