袁 磊，張國華，Faizan Ahmed SADIQ，何國慶*

發(fā)酵條件對紅茶菌發(fā)酵品質及風味的影響

袁 磊，張國華，Faizan Ahmed SADIQ，何國慶*

（浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058）

探究發(fā)酵條件對紅茶菌發(fā)酵品質及發(fā)酵液風味的影響。以發(fā)酵產酸率、感官評分為指標，考察紅茶品種、茶葉浸提方式、糖添加量、茶葉添加量及紅茶菌膜接種量的影響；同時，對發(fā)酵過程中風味物質的變化進行分析。結果表明：將水煮沸后，加0.5%醇香紅茶浸提15 min，加入7%糖，冷卻后加8%紅茶菌膜于30 ℃條件下發(fā)酵10 d，得到的產品感官品質好，發(fā)酵液呈清澈淡黃色，酸甜適中，微酸，口味純；茶湯經發(fā)酵后風味物質顯著改變，共檢測到19 種風味成分，其中醇類7 種、酯類6 種、酸類4 種、酚類1 種、烷烴類1 種，即風味物質多為醇類、酯類和酸類。醇類的含量為25.09%，其中乙醇含量為21.51%；酸類的含量為46.40%，其中正辛酸含量為19.41%；酯類的含量為15.91%，其中乙酸乙酯含量為9.47%。

紅茶菌；紅茶；發(fā)酵；風味

紅茶菌起源于我國渤海一帶，約在150年前陸續(xù)傳至蘇聯的西伯利亞、高加索、貝加爾湖一帶。到20世紀70年代，紅茶菌湯風靡日本，后又流傳到新加坡、馬來西亞、中國香港、美國、加拿大和俄羅斯等國家和地區(qū)[1]。紅茶菌是以糖茶水為發(fā)酵基質，經醋酸菌、酵母菌及乳酸菌等微生物共同發(fā)酵而形成，具有微甜、微酸、爽口的民間傳統(tǒng)酸性飲料[2]。紅茶菌發(fā)酵菌液中富含葡萄糖酸、醋酸、D-葡萄糖二酸-1,4-內酯、乳酸、氨基酸、維生素和茶多酚等有益成分[3-6]，且具有抑菌[7]、抗癌[8]、提高機體免疫[9]、預防和治療高血壓[10]、高血脂[11]、動脈硬化[12]等心血管疾病的保健功效。發(fā)酵后產生大量的有機酸、醇和酯類物質，對風味及感官品質也有很大改善[13]。

紅茶菌一直是家庭自制自飲。由于菌種生長、組成、保存的特殊性以及發(fā)酵過程的復雜性，而未能工業(yè)化生產。不同的發(fā)酵條件對發(fā)酵液品質有顯著影響[14-17]。此外，微生物在發(fā)酵代謝過程中產生的酸類、醇類、酯類等小分子物質顯著改變茶水原有的風味，進而影響產品的品質。因此，開展紅茶菌發(fā)酵的研究對推動食品飲料工業(yè)的發(fā)展有重要意義。

本實驗以4 種不同品種的紅茶為原料，研究不同茶浸提方式、茶葉添加量、糖添加量及紅茶菌膜接種量對發(fā)酵品質的影響，并對發(fā)酵液的風味進行解析，為紅茶菌功能性飲料的研究和開發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：紅茶菌菌種，本實驗室保存。紅茶：醇香紅茶、大吉嶺紅茶、武夷巖茶和源山野紅茶，由上海融揚生物技術有限公司提供，分別記為A、B、C、D。

硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、乙酸鋅、冰乙酸、亞鐵氰化鉀、鹽酸、葡萄糖、硫酸亞鐵均為國產分析純。1.2 儀器與設備

6890N-5973I氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用儀、DB-WAX毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）裝置的手柄、固定搭載裝置、65 μm PDMS/DVB萃取頭 美國Supelco公司；SP-756PC型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；PB-10 pH計 賽多利斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅茶發(fā)酵流程

紅茶經熱水浸提后濾出茶葉渣、添加白砂糖得到茶湯。茶湯冷卻至室溫后接入菌膜，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵10 d[18]。

1.3.2 感官評價標準

感官評價標準見表1。

表1 紅茶菌產品感官評定標準Table1 Criteria for sensory evaluation of fermented black tea

1.3.3 理化指標測定

pH值：pH計直接測量；總酸含量：參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》；還原糖、總糖含量：參考GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》；茶多酚含量：參考GB/T 21733—2008《茶飲料》。

1.3.4 單因素試驗

以產酸率和感官評分為指標，選取不同紅茶品種、紅茶浸提方式、糖添加量、茶葉添加量和紅茶菌膜接種量5 個因素進行單因素試驗。本實驗中分別選擇如下3 種浸提方式：E：將水煮沸，放入茶葉浸提15 min后，加入糖；F：將水煮沸后冷卻至80 ℃，放入茶葉浸提15 min后，加入糖；G：將茶葉、糖放入水中直接煮沸。以產酸率和感官評分為指標。產酸率的計算如式（1）所示：

1.3.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上選擇糖添加量、茶葉添加量及紅茶菌膜接種量作考察因素，以產酸率和感官評分為指標，設計L9（33）的正交試驗，因素和水平如表2所示。

表2 正交試驗因素與水平Table2 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.6 SPME-GC-MS的風味測定

將2.0 mL分析樣品裝入15 mL萃取瓶中，放置于一定溫度水浴中并保持30 min，然后將已老化好的萃取頭（65 μm PDMS/DVB）插入到萃取瓶中進行萃取，萃取結束后，取出纖維頭并插入到氣相色譜汽化室中進行GC-MS分析。

GC條件：采用DB-WAX毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.2 5 μ m），載氣為H e，流速為1 m L/m i n。色譜柱升溫程序為：起始柱溫35 ℃，保持4 min，以4 ℃/min升到100 ℃，保持2 min，然后以3 ℃/min升到150 ℃，最后以10 ℃/min升到230 ℃，保持2 min。進樣口溫度250 ℃，無分流進樣。

MS條件：電子電離源，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，四極桿溫度150 ℃，檢測器溫度280 ℃，掃描模式為全掃描，質量范圍20～350 u。

化合物的鑒定通過NIST08譜庫對比和計算待測物的保留指數確定，同時采用面積歸一法計算各揮發(fā)性組分的相對含量。保留指數（retention index，RI）計算如式（2）所示：

式中：n為碳原子數；tn為碳原子數為n的正構烷烴的保留時間/min；tn＋1為碳原子數為n＋1的正構烷烴的保留時間/min；ti為為樣品i的保留時間/min。

2 結果與分析

2.1 紅茶原料與發(fā)酵條件對產酸與品質的影響

2.1.1 紅茶原料種類對產酸與品質的影響

圖1 茶種類對發(fā)酵結果的影響Fig. 1 Effects of different types of black tea on fermentation

不同紅茶品種中碳源、氮源等微生物營養(yǎng)素存在差異，對發(fā)酵結果有影響[19]。如圖1所示，茶A的產酸率最高，達61%，茶B的產酸率最低，僅為44.8%。此外，茶A的感官評分最高，為88.40，茶香濃郁，口感滋潤，而茶C的紅茶味較淡，入口澀嘴，感官評分僅為72.95。故選紅茶A為后續(xù)研究的紅茶品種。

2.1.2 紅茶浸提條件對產酸與品質的影響

圖2 茶浸提方式對發(fā)酵的影響Fig. 2 Effects of tea brewing methods on fermentation

不同的浸提條件，如浸提溫度、浸提時間等，影響茶葉中溶出物的含量，進而對發(fā)酵結果有影響[20]。如圖2所示，經條件E浸提后發(fā)酵的產酸率最高，為59.7%，而經條件G浸提后發(fā)酵的產酸率最低，僅為43.9%。較高的浸提溫度有利于茶葉中的碳源氮源、無機鹽等物質的溶出；方法G中直接將糖與茶葉一起煮沸浸提，可能導致在過濾茶葉時應部分糖黏附在茶葉上，導致茶水中的糖含量降低，從而降低發(fā)酵產酸率。3種不同茶葉浸提方式得到產品的感官評分則無顯著性差異，分別為85.59、82.19和81.36。故選擇條件E作為茶葉浸提工藝。

圖3 糖添加量對發(fā)酵的影響Fig. 3 Effects of sugar concentration on fermentation

2.1.3 糖添加量對產酸與品質的影響糖是微生物生長的重要能源，適當的糖添加量利于紅茶菌中酵母、醋酸菌和乳酸菌的生長[21]。如圖3所示，糖添加量為3%時產酸率最低，隨著糖添加量的升高，產酸率不斷上升，糖添加量為7%時產酸率為60.6%，糖添加量為10%時產酸率為60.9%。此外，有報道稱，較大的糖添加量形成的高滲透壓會對微生物有抑制作用[22]。糖添加量對產品感官的影響顯著。當糖添加量較低時，口味較淡，色澤淺，而當糖添加量達10%時，產品過甜，且色澤太深。Goh等[17]也發(fā)現，當糖質量濃度高于110 g/L時，微生物的生長受到抑制，故不宜添加高濃度的糖。

2.1.4 茶葉添加量對產酸與品質的影響

圖4 茶葉添加量對發(fā)酵的影響Fig. 4 Effects of tea concentration on fermentation

茶葉含有糖類、氨基酸、維生素及礦物質等豐富的營養(yǎng)物，對紅茶菌的生長繁殖有顯著影響。如圖4所示，茶葉添加量越大，茶水中的營養(yǎng)物質更加豐富，微生物生長旺盛，產酸率也越高：當茶葉添加量為0.5%時，產酸率為60.6%，當茶葉添加量為0.8%時產酸率高達61.4%。但高含量的茶導致發(fā)酵液的澀味、酸味較重，顏色較深，感官不佳。故綜合考慮茶葉添加量為0.5%。但當茶葉添加量較低時，得到的紅茶菌飲料茶香味不足；隨著茶葉添加量的增加，紅茶菌發(fā)酵液的澀味增加。茶多酚物質含量的增加在一定程度上增強對紅茶菌中微生物的生長抑制作用，導致菌膜生成量呈現下降趨勢[23]。

2.1.5 紅茶菌膜接種量對產酸與品質的影響

如圖5所示，隨著接種量的增加，發(fā)酵速度和產酸率提高。接種量為4%的產酸率為56.6%，接種量為6%時的產酸率為60.2%，接種量為8%的產酸率為62%，接種量為10%的產酸率為61.8%。但是，較高的菌種添加量導致發(fā)酵過度，接種量為10%的感官評分僅為72.05，菌液的酸度高，酸味刺鼻，菌膜生長狀態(tài)不佳。任二芳等[24]則認為，當接種量過大時，菌膜中微生物會大量消耗發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質用于它們自身的繁殖，同時伴隨著大量代謝廢物的產生，從而不利于獲得所需的發(fā)酵產物，且發(fā)酵液中總酸含量過大，影響發(fā)酵液品質。

圖5 紅茶菌膜接種量對發(fā)酵的影響Fig. 5 Effects of inoculum size on fermentation

2.2 最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，研究影響紅茶菌發(fā)酵的3 個因素：糖添加量（A）、茶葉添加量（B）和接種量（C），每個因素選取3 個水平，結果如表3所示。

表3 正交試驗優(yōu)化發(fā)酵條件Table3 Orthogonal array design with experimental results for the optimization of fermentation conditions

由表3可知，選擇的3 個因素對產酸率的影響程度由大到小依次為C＞A＞B，即接種量＞糖添加量＞茶葉添加量，最優(yōu)水平為A2B2C3，即糖添加量7%、茶葉添加量0.5%、接種量8%。此時的感官評分91.36。發(fā)酵液呈清澈淡黃色，酸甜適中，有甜香味，微酸，口味純，口感細膩潤滑，氣味協(xié)調柔和。在此最佳發(fā)酵條件下進行驗證實驗，產酸率為60.9%，感官評分為92.31，說明優(yōu)化實驗的準確性較高。

2.3 紅茶發(fā)酵前后風味物質的變化

采用SPME-GC-MS對紅茶湯及發(fā)酵后發(fā)酵液的風味物質進行分析，并根據它們的變化規(guī)律做分類。如圖6和表4所示，紅茶湯中共14 種風味成分，其中醛類3 種、醇類3 種、酯類2 種、酸類3 種、酮類1 種、酚類1 種、烷烴類1 種。發(fā)酵后的茶水共19 種風味成分，其中醇類7 種、酯類6 種、酸類4 種、酚類1 種、烷烴類1 種。這說明發(fā)酵后的茶水風味物質增加，且風味物質多為醇類、酯類和酸類。醇類的含量為25.09%，其中乙醇含量為21.51%；酸類的含量為46.40%，與紅茶湯的5.59%相比明顯提高，這也與發(fā)酵過程中總酸和pH值的變化一致。此外，酯類的含量為15.91%，這是由于酸類和醇類物質的增加且發(fā)生酯化反應。風味的差異來源于紅茶菌中微生物的代謝，即在發(fā)酵初期蔗糖先被酵母菌分解成葡萄糖和果糖，并進一步發(fā)酵產生乙醇，醋酸菌則在培養(yǎng)液中有葡萄糖、果糖和乙醇后開始大量繁殖，并將葡萄糖和果糖氧化成葡萄糖酸、乙酸等代謝產物。酵母菌產生的乙醇能刺激醋酸菌的生長產生更多乙酸，而醋酸菌產生的乙酸又會刺激酵母菌產生乙醇[25]。

圖6 紅茶發(fā)酵前（A）、后（B）風味物質檢測GC-MS圖譜Fig. 6 GC-MS profiles of volatile compounds in black tea and fermented black tea

表4 紅茶發(fā)酵前后風味物質的變化Table4 Changes in flavor compounds between black tea and fermented black tea

3 結 論

在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗對傳統(tǒng)紅茶菌發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，發(fā)現不同發(fā)酵工藝對產品品質有影響：以醇香紅茶為原料，將水煮沸后放入0.5%茶葉浸提15 min后，加入7%蔗糖，冷卻至室溫后接入8%紅茶菌膜于30 ℃條件下發(fā)酵10 d，此時產品感官品質好，發(fā)酵液呈清澈淡黃色，酸甜適中，微酸，口味純，氣味協(xié)調柔和。

紅茶湯經發(fā)酵后風味物質顯著改變，共有19 種風味成分，其中醇類7 種、酯類6 種、酸類4 種、酚類1 種、烷烴類1 種，即風味物質多為醇類、酯類和酸類。醇類的含量為25.09%，其中乙醇含量為21.51%；酸類的含量為46.40%，其中正辛酸含量為19.41%；酯類含量為15.91%，其中乙酸乙酯含量為9.47%。

鑒于人們對保健養(yǎng)生的不斷重視及紅茶菌的多重保健功效，目前除紅茶菌飲料外，已開發(fā)出紅茶菌面包、紅茶菌酸奶、紅茶菌芝麻酥等各種產品，這必將對推動紅茶菌產業(yè)發(fā)展、豐富人們飲食文化有重要意義。

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Effects of Fermentation Conditions on Quality and Flavor of Kombucha

YUAN Lei, ZHANG Guohua, Faizan Ahmed SADIQ, HE Guoqing*
(College of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

The objective of this study was to analyze how different fermentation methods can affect the fermentation prof le of kombucha in terms of its f avor, fermentation yield (total acid/sugar consumption) and sensory evaluation. The variable factors considered included black tea type, tea extraction modes, concentrations of sugar and tea and inoculum size of starter culture. The optimized conditions for the best quality of kombucha were obtained after adding 0.5% mellow black tea to boiling water and keeping it at room temperature for 15 min, followed by the addition of 7% sugar and 8% komucha starter culture. Finally, the fermentation process was carried out at 30 ℃ for 10 days. After fermentation the broth was clear with pale yellow color, and sweet and moderately sour taste. A considerable change in f avor prof le was observed before and after the fermentation under the optimized conditions. A total of 19 volatile aroma compounds were identif ed including 7 alcohols, 6 esters, 4 acids, 1 phenol and 1 hydrocarbon. The contents of alcohols, acids and esters were 25.09%, 46.40% and 15.91%, respectively.

kombucha; black tea; fermentation; flavor

10.7506/spkx1002-6630-201702015

TS201.3

A

1002-6630（2017）02-0092-06

袁磊, 張國華, SADIQ F A, 等. 發(fā)酵條件對紅茶菌發(fā)酵品質及風味的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(2): 92-97.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702015. http://www.spkx.net.cn

YUAN Lei, ZHANG Guohua, SADIQ F A, et al. Effects of fermentation conditions on quality and flavor of kombuchaz[J]. Food Science, 2017, 38(2): 92-97. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702015.

http://www.spkx.net.cn

2016-03-29

中國博士后科學基金資助項目（2016M592002）

袁磊（1989—），男，博士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：leiyuan@zju.edu.cn

*通信作者：何國慶（1957—），男，教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：gqhe@zju.edu.cn