張衛(wèi)軍　陳　建

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永州山銀花中綠原酸提取工藝研究及含量測(cè)定

張衛(wèi)軍陳建

（湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州 425199）

論文以永州山銀花為原料，以山銀花中綠原酸的含量為考察指標(biāo)，采用乙醇回流提取法和紫外可見(jiàn)分光光度法，通過(guò)單因素試驗(yàn)研究了乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提時(shí)間、浸提溫度、料液比對(duì)山銀花中綠原酸浸提量的影響。利用正交試驗(yàn)優(yōu)化選擇，以主要影響因素做正交試驗(yàn)。通過(guò)方差分析得到最佳提取工藝為：料液比1：20，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，浸提溫度70℃，提取時(shí)間120 min。在此條件下綠原酸提取得率為2.86%。此法簡(jiǎn)單可行，經(jīng)濟(jì)適用且環(huán)保，適于工業(yè)化大生產(chǎn)。

永州山銀花；綠原酸；提取工藝

1　引　言

山銀花為忍冬科植物紅腺忍冬、灰氈毛忍冬、華南忍冬或黃褐毛忍冬的干燥花蕾或初開(kāi)的花[1]，具有清熱解毒、護(hù)肝明目、抗菌、降壓、免疫調(diào)節(jié)等功效[2]。山銀花的主要有效成分是有機(jī)酸類(lèi)、黃酮類(lèi)化合物及皂苷，其中綠原酸是山銀花的主要藥效活性成分之一[3]。綠原酸還是食品、藥品、化妝品等工業(yè)的重要原料[4-5]。近來(lái)研究表明綠原酸還具有抗白血病的作用[6]。因此，開(kāi)發(fā)綠原酸市場(chǎng)前景廣闊、發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

天然藥物之所以具有重要藥用價(jià)值，其原因在于其所含的有效成分具有生物活性[7]。據(jù)中藥特點(diǎn)，有效成分不僅是藥用植物的藥效基礎(chǔ)，也是評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的有效指標(biāo)。大量研究表明：中藥材所含化學(xué)成分復(fù)雜多樣，有效成分的含量受地理氣候因素影響較大[8-10]。綠原酸是山銀花中的重要活性成分之一，其含量也應(yīng)受氣候，溫度，地域等條件的影響。因此，對(duì)不同地域、不同氣候、不同土壤環(huán)境下的山銀花中綠原酸成分含量展開(kāi)研究，對(duì)于“南北金銀花”之爭(zhēng)及山銀花質(zhì)量全面控制和科學(xué)評(píng)價(jià)具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

永州氣候宜人，土壤肥沃，野生山銀花資源豐富，但山銀花研究文獻(xiàn)報(bào)道卻是空白。為擴(kuò)大中藥的藥源途徑，有必要對(duì)湖南永州地區(qū)的山銀花進(jìn)行提取工藝研究及含量測(cè)定，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)湖南地區(qū)山銀花產(chǎn)業(yè)提供參考和依據(jù)。

2　材料、試劑及儀器

2.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)原料為永州地區(qū)山銀花，課題組于2016年4-5月分2次采摘，樣品采后及時(shí)陰干并放入45℃干燥箱中干燥，經(jīng)粉碎、過(guò)60目試樣篩，密封室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2主要儀器

AUY-120電子分析天平，購(gòu)自日本島津公司；752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；A-88型組織搗碎均勻機(jī)，購(gòu)自金坊市醫(yī)療儀器廠；FW177型中草藥粉碎機(jī)和WG-20型電熱鼓風(fēng)干燥箱，均購(gòu)自天津市泰斯特儀器有限公司；RE-201D型電熱恒溫水浴鍋，購(gòu)自長(zhǎng)沙太康科技有限公司。

2.3主要試劑

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水乙醇為分析純，實(shí)驗(yàn)所用的50%、70%、90%濃度的乙醇溶液均由此分析純稀釋而來(lái)。

3　方法與實(shí)驗(yàn)

3.1對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取綠原酸對(duì)照品5.1 mg，精密稱(chēng)定，置于50 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶液并定容至50 mL，搖勻得102 μg/mL的綠原酸對(duì)照品溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)此溶液濃度過(guò)大，因此取15 mL濃度為102 μg/mL的綠原酸對(duì)照品溶液于50 mL容量瓶中，配制成濃度為30.6 μg/mL的對(duì)照品溶液。放入冰箱（4℃）待用。

3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)相關(guān)參考文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)確定最大吸收波長(zhǎng)為328.8 nm。

3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用5 mL移液管精密量取對(duì)照品溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶液定容，搖勻，靜置。其濃度分別為0μg/mL、1.224μg/mL、2.448μg/mL、3.67μg/mL、4.896μg/mL、6.120μg/mL、7.464μg/mL。在328.8 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖1）。求得線性回歸方程為y＝0.0842x+0.0206，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9998。

圖1. 綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.4樣品中綠原酸提取及含量測(cè)定

取山銀花粉末0.2 g，精密稱(chēng)定，置于提取器中，加一定料液比的乙醇溶液，加熱回流一定時(shí)間，提取完成后冷卻至室溫，用抽濾機(jī)兩次抽慮合并濾液。將濾液即提取液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用相應(yīng)濃度的乙醇溶液定容至刻度線。用移液管移取1mL放置于另一個(gè)25 mL容量瓶中，用相應(yīng)濃度的乙醇溶液定容至刻度線。用紫外分光光度計(jì)測(cè)得其吸光度，測(cè)三組，取其平均值。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線算出其濃度。

測(cè)得吸光度A，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得濃度C（mg/L）

4　結(jié)果與分析

4.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

4.1.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山銀花綠原酸提取得率的影響。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2克/份的山銀花樣品四份，料液比為1∶20。選取提取溶劑分別為50%、60%、70%、90%乙醇溶液，提取溫度為70℃，提取時(shí)間為2小時(shí)。按３.4方法操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。

圖2. 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山銀花中綠原酸提取得率的影響

由圖2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在70%之前綠原酸提取得率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)達(dá)到最大值，之后呈下降趨勢(shì)，且下降趨勢(shì)大，是因?yàn)殡S著濃度增加，醇溶性物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)溶解，使山銀花中綠原酸成分溶解度下降，導(dǎo)致了提取率下降。因此，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70 %時(shí)山銀花中綠原酸的提取效果最好。

4.1.2料液比對(duì)山銀花綠原酸提取得得率的影響。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2克/份的山銀花樣品四份，分別加入液料比為1:10、1:15、1:20、1:25（g/mL）。提取溶劑為70%的乙醇溶液，提取溫度為70℃，提取時(shí)間為2小時(shí)。按3.4方法操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。

圖3. 料液比對(duì)山銀花中綠原酸提取得率的影響

由圖3可以看出，綠原酸提取率隨著料液比的不斷增大而變大，當(dāng)料液比達(dá)到1：20后，綠原酸的提取率的增幅變化不大，且有下降趨勢(shì)并開(kāi)始下降?？赡苁且?yàn)橐掖己吭龈?，其他物質(zhì)的提取率也隨著增高了，從而影響了綠原酸的提取。所以適宜的料液比為1：20左右。

4.1.3提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2克/份的山銀花樣品四份，提取溶劑為70%的乙醇溶液，液料比為1:20，提取溫度為70℃，提取時(shí)間為分別為1小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)、2.5小時(shí)。按3.4方法操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4。

圖4. 提取時(shí)間對(duì)山銀花中綠原酸提取率的影響

由圖4可以看出，提取時(shí)間在1.5-2.0小時(shí)之間綠原酸提取率好。2小時(shí)前隨著提取時(shí)間的增加提取率的增幅也不大，2小時(shí)后略有降低，可能是隨著時(shí)間的增加，山銀花中的其它成分或雜質(zhì)浸入提取液中，導(dǎo)致綠原酸的提取率略有降低?？紤]經(jīng)濟(jì)因素，最宜的提取時(shí)間選2小時(shí)。

4.1.4溫度對(duì)綠原酸提取率的影響。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2克/份的山銀花樣品四份，分別于65℃、70℃、75℃、80℃條件下提取，提取溶劑為70%的乙醇溶液，液料比為1:20，提取時(shí)間為2小時(shí)。按3.4方法操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5. 提取溫度對(duì)山銀花中綠原酸提取率的影響

由圖5可以看出，隨著提取溫度的增加，提取率先升后降，當(dāng)溫度達(dá)到70℃時(shí)提取率最高，在70℃前上升的幅度較小，超過(guò)70℃后提取率下降幅度較大，原因可能是溫度升高使綠原酸成份受熱被破壞，導(dǎo)致提取率在一定程度上下降。另外，溫度的升高乙醇的揮發(fā)會(huì)越來(lái)越劇烈，乙醇的消耗會(huì)增加，不利于實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，選擇最宜的提取溫度為70℃。

4.2正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

4.2.1正交試驗(yàn)結(jié)果。在綠原酸的提取過(guò)程中，乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度等因素都影響綠原酸的提取得率。根據(jù)綠原酸的結(jié)構(gòu)性質(zhì)及單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和傳統(tǒng)的提取經(jīng)驗(yàn)，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C) 3個(gè)因素，以綠原酸得率為指標(biāo)，采用L9（34）設(shè)計(jì)進(jìn)行正交試驗(yàn)，其因素水平表和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表1、表2。

表1. 正交分析表

所在列ABC 因素提取時(shí)間提取溫度乙醇體積分?jǐn)?shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(%) 實(shí)驗(yàn)11(1h)1(65℃)1(50%)2.50 實(shí)驗(yàn)22(1.5)2(70℃）1(50%)2.69 實(shí)驗(yàn)33(2h)3(75℃)1(50%)2.57 實(shí)驗(yàn)42(1.5h)1(65℃)2(70%)2.64 實(shí)驗(yàn)53(2h)2(70℃）2(70%)2.86 實(shí)驗(yàn)61(1h)3(75℃)2(70%)2.70 實(shí)驗(yàn)73(2h)1(65℃)3(90%)2.84 實(shí)驗(yàn)81(1)2(70℃）3(90%)2.80 實(shí)驗(yàn)92(1.5h)3(75℃)3(90%)2.82 k12.5872.6602.667 k22.7332.7832.717 k32.8202.6972.757 R0.2330.1230.090

表2 . 二次回歸方程模型的方差分析表

由表1可以得出各個(gè)因素的對(duì)綠原酸提取率的影響順序?yàn)镽A>RB>RC，預(yù)測(cè)最佳組合為A3B2C2；從表2方差分析數(shù)據(jù)可知提取時(shí)間，提取溫度為重要因素，乙醇體積分?jǐn)?shù)為次要影響，故在工業(yè)化生產(chǎn)中因?qū)⑻崛r(shí)間和提取溫度作為關(guān)鍵因素考慮。

4.2.2結(jié)果驗(yàn)證試驗(yàn)。為了驗(yàn)證正交設(shè)計(jì)選取出來(lái)的最佳工藝路線的可靠性，以最佳提取條件A3B2C2做三組平行試驗(yàn)，山銀銀花以1:20的料液比加入70%乙醇溶液，溫度為70℃的條件下單次，提取2小時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3。第一次驗(yàn)證試驗(yàn)所得到的結(jié)果為2.84%，第二次驗(yàn)證試驗(yàn)所得到的結(jié)果為2.79%，第三次驗(yàn)證試驗(yàn)所得到的結(jié)果為2.81%。由數(shù)據(jù)所得三組試驗(yàn)的結(jié)果相差不大，故最佳的工藝路線為A3B2C2。

表3. 最優(yōu)組合條件下的結(jié)果驗(yàn)證

試驗(yàn)號(hào)提取率平均值RSD 12.84% 22.79%2.81%0.89% 32.81%

5　結(jié)　論

以永州產(chǎn)野生山銀花為原料，乙醇水溶液為提取劑，經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)正交試驗(yàn)得出綠原酸提取最優(yōu)條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取溫度為70℃，提取時(shí)間2小時(shí)，料液比1:20。在此條件下的最優(yōu)提取得率為2.86%，符合國(guó)家藥典規(guī)定藥用金銀花中綠原酸最低質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的要求。文章提供永州產(chǎn)山銀花化學(xué)活性成分——綠原酸含量等基礎(chǔ)資料，為揭示永州山銀花綠原酸含量及品質(zhì)與地理氣候因素之間的關(guān)系，為山銀花產(chǎn)地溯源提供參考依據(jù)。

乙醇回流提取山銀花中的綠原酸是一種比較高效率的提取方法，操作簡(jiǎn)單、條件溫和，節(jié)約成本、耗時(shí)短，能夠滿足工廠的大規(guī)模生產(chǎn)。

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（責(zé)任編校：宮彥軍）

2017－01－08

張衛(wèi)軍（1969－），男，湖南永州人，湖南科技學(xué)院研究員，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)與分析化學(xué)。

S567.9

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1673-2219（2017）10-0051-03