劉蒲臨++程德勇++繆禮鴻

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.135

摘要：在紫外誘變的基礎(chǔ)上，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus） M64發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)粗酶液的酶學(xué)特性進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，碳氮源的種類(lèi)與濃度、培養(yǎng)溫度、pH值以及表面活性劑吐溫80濃度對(duì)該菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶有顯著影響。突變株使用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件，其發(fā)酵上清液中幾丁質(zhì)酶活力達(dá)到55.19 U/mL，為未優(yōu)化前的2.56倍；粗酶液最適催化溫度為60 ℃，且在80 ℃預(yù)處理2 h后仍具有降解幾丁質(zhì)的能力，表現(xiàn)出了良好的熱穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：側(cè)孢短芽孢桿菌；幾丁質(zhì)酶；產(chǎn)酶條件；酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類(lèi)號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）10-0468-04

收稿日期：2015-09-29

基金項(xiàng)目：國(guó)家“863”高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：2013AA102805）；武漢輕工大學(xué)科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)（編號(hào)：2014RZ19）。

作者簡(jiǎn)介：劉蒲臨（1985—），男，湖北武漢人，博士，講師，主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究。Tel：（027）83956793；E-mail：liunan3585@163.com。

通信作者：繆禮鴻，博士，教授，主要從事資源與環(huán)境微生物學(xué)研究。Tel：（027）83956793；E-mail：miaowhpu@126.com。幾丁質(zhì)是由幾丁質(zhì)合酶以尿嘧啶二磷酸-N-乙酰葡糖胺為前體，催化N-乙酰葡糖胺以β-1，4糖苷鍵相連形成長(zhǎng)鏈后，不同長(zhǎng)鏈之間以反平行（α型）或平行（β型）的方式相互作用所形成的[1]。幾丁質(zhì)是構(gòu)成絲狀真菌和擔(dān)子菌細(xì)胞壁的主要成分，同時(shí)廣泛存在于節(jié)肢動(dòng)物外骨骼和甲殼綱動(dòng)物的外殼中[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，自然界中每年產(chǎn)生的幾丁質(zhì)超過(guò)100億t，是僅次于纖維素的第二大有機(jī)物[3]。

幾丁質(zhì)酶可以催化幾丁質(zhì)的水解，廣泛存在于微生物和高等動(dòng)植物體內(nèi)[4]。微生物所產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶除了可以水解幾丁質(zhì)獲取營(yíng)養(yǎng)、賦予細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)或寄生優(yōu)勢(shì)以外，還可以降解真菌細(xì)胞壁和昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)外殼，進(jìn)而應(yīng)用于植物的病蟲(chóng)害防治[5]。此外，幾丁質(zhì)降解所形成的幾丁寡糖具有抗菌、調(diào)節(jié)免疫力和抗癌等功效，在功能食品和保健藥品等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[6-7]。因此本研究以前期篩選得到的具有幾丁質(zhì)降解能力的側(cè)孢短芽孢桿菌M64為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外誘變和正交試驗(yàn)等手段提高和優(yōu)化其發(fā)酵產(chǎn)酶能力并研究了粗酶液的部分酶學(xué)性質(zhì)，為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)其所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

側(cè)孢短芽孢桿菌M64，由筆者所在課題組前期篩選得到。幾丁質(zhì)粉末購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1膠體幾丁質(zhì)制備將10 g幾丁質(zhì)粉末加入100 mL濃鹽酸中，磁力攪拌2 h后室溫靜置24 h。將幾丁質(zhì)的酸溶液轉(zhuǎn)移至1 L蒸餾水中，攪拌均勻。5 000 g離心10 min收集膠體幾丁質(zhì)沉淀。使用蒸餾水反復(fù)沖洗至pH值為6.5左右。最終使用200 mL蒸餾水重懸沉淀，獲得5%的膠體幾丁質(zhì)母液。

1.2.2培養(yǎng)基配制（1）菌體擴(kuò)增與計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。（2）初始發(fā)酵培養(yǎng)基，在Hoster等所使用培養(yǎng)基配方[8]基礎(chǔ)上有所更改：膠體幾丁質(zhì) 5.0 g/L，酵母膏 2.0 g/L，KH2PO4 3.0 g/L，K2HPO4 2.0 g/L，CaCl2·2H2O 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L。（3）突變株篩選培養(yǎng)基：初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加瓊脂至濃度為15.0 g/L。

1.2.3幾丁質(zhì)酶酶活測(cè)定使用DNS法（3，5-二硝基水楊酸比色法）[9]，以β-D-N-乙酰氨基葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別對(duì)待測(cè)樣品以及樣品空白進(jìn)行測(cè)定。將1 min產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmol β-D-N-乙酰氨基葡萄糖的還原糖所需的酶量定義為1個(gè)活力單位（U）。

1.2.4紫外誘變與突變株篩選將出發(fā)菌株接種至50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng) 10 h。離心收集菌體，使用50 mL無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行重懸，平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌懸液濃度。轉(zhuǎn)移5 mL菌懸液至無(wú)菌培養(yǎng)皿中，在距離40 W紫外燈50 cm處，分別處理15～105 s。紫外照射完畢后，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，并按照以下公式計(jì)算致死率：

致死率=（照射前菌懸液濃度-照射后菌懸液濃度）/照射前菌液濃度×100%。

觀察并測(cè)定菌落在膠體幾丁質(zhì)固體培養(yǎng)基上所形成的水解圈大小。挑取水解圈較大的單菌落接種至初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，測(cè)定發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶的酶活。

1.2.5培養(yǎng)條件優(yōu)化以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過(guò)單因素試驗(yàn)分別考察pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和吐溫80濃度對(duì)發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶活力的影響。

1.2.6培養(yǎng)基優(yōu)化通過(guò)單因素試驗(yàn)確定不同培養(yǎng)基成分對(duì)發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶活力的影響，選取影響較大的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定M64產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最佳培養(yǎng)基構(gòu)成。

1.2.7粗酶液酶學(xué)性質(zhì)研究（1）最適溫度和pH值的測(cè)定：分別于20～80 ℃以及pH值為3.0～10.0條件下測(cè)定發(fā)酵上清液中幾丁質(zhì)酶的活性。（2）熱穩(wěn)定性的測(cè)定：將發(fā)酵上清液置于20～80 ℃下水浴 2 h 后檢測(cè)酶活。

2結(jié)果與分析

2.1紫外誘變與突變株篩選

2.1.1紫外致死曲線菌株M64的紫外致死曲線如圖1所示。當(dāng)紫外處理時(shí)間為15 s時(shí)，菌體致死率為9.02%。隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)至60 s，菌體致死率增長(zhǎng)至87.22%。當(dāng)紫外處理時(shí)間大于75 s時(shí)，菌體致死率已接近100%。本試驗(yàn)選擇致死率在80%～90%的紫外線劑量，確定誘變所使用照射時(shí)間為60 s。

2.1.2紫外誘變后菌株的篩選經(jīng)過(guò)紫外誘變的菌懸液經(jīng)梯度稀釋后涂布于含有1%膠體幾丁質(zhì)的固體培養(yǎng)平板上，避光培養(yǎng)72 h后觀察透明圈產(chǎn)生情況。測(cè)量并計(jì)算透明圈直徑（H）與菌落直徑（C）的比值，從中挑選出比值較大的單菌落完成初篩。將比值較大的10株突變株分別劃線純化，培養(yǎng)形成種子液后以1%接種量接種至初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，使用DNS法測(cè)定發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶活力。突變株篩選結(jié)果如表1所示。其中，菌株 M64-7幾丁質(zhì)酶活力最高，達(dá)到32.30 U/mL，為野生型菌株的1.50倍。突變株M64-7經(jīng)過(guò)多次劃線傳代后酶活力保持穩(wěn)定，具有較好的遺傳穩(wěn)定性，故以突變株M64-7進(jìn)行后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)。

2.2突變株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1培養(yǎng)時(shí)間對(duì)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響將過(guò)夜培養(yǎng)的突變株M64-7的菌液以1%接種量接種于初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)，每隔6 h測(cè)定發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶活和菌體生長(zhǎng)量。圖2表明，菌株M64-7在36 h產(chǎn)酶達(dá)到最大值，36 h與42 h幾丁質(zhì)酶活差異不顯著。發(fā)酵液酶活變化曲線與菌體生長(zhǎng)情況表現(xiàn)出了良好的一致性。

2.2.2培養(yǎng)溫度與起始pH值對(duì)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響將突變株M64-7的種子液以1%接種量接種至不同pH值或不同培養(yǎng)溫度的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)（180 r/min），36 h后測(cè)定發(fā)酵液中的幾丁質(zhì)酶活力。圖3表明，該菌株在初始pH值為7.0以及培養(yǎng)溫度為37 ℃時(shí)，產(chǎn)酶達(dá)到最高水平。

2.2.3吐溫80含量對(duì)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響表面活性劑能增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，從而提高幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量。將非離子表面活性劑吐溫80添加至初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，至終濃度分別為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%。在最適pH值和培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)36 h后，發(fā)酵上清液中的酶活如圖4所示。當(dāng)吐溫濃度小于0.2%時(shí)，發(fā)酵液酶活隨著吐溫80濃度的增大而增強(qiáng)；吐溫80濃度為0.2%時(shí)，發(fā)酵液酶活達(dá)到最大值。因此，本研究最終選擇培養(yǎng)基中的吐溫80濃度為0.2%。

2.3不同的培養(yǎng)基成分對(duì)發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響

2.3.1氮源種類(lèi)與濃度對(duì)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在其他成分不變的條件下，分別添加不同濃度的酵母膏、胰蛋白胨、牛肉膏、NH4Cl以及KNO3，比較不同氮源對(duì)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響。在相同接種量和培養(yǎng)條件下，以有機(jī)物作為氮源有助于幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的提高，當(dāng)培養(yǎng)基中含有8.0 g/L的酵母膏時(shí)，發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶活力達(dá)到 49.68 U/mL（圖5-a）；而向培養(yǎng)基中添加無(wú)機(jī)氮（NH4Cl與KNO3）不會(huì)顯著影響幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量（圖5-b）。

2.3.2碳源種類(lèi)與濃度對(duì)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響在培養(yǎng)基中其他成分不變的條件下，分別添加不同濃度的膠體幾丁質(zhì)、葡萄糖和蔗糖，比較不同碳源對(duì)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖6所示。膠體幾丁質(zhì)含量由0.5%增加至2.5%時(shí)，幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量先逐漸增加后趨于平緩，說(shuō)明該菌株幾丁質(zhì)酶的表達(dá)受到外源幾丁質(zhì)的誘導(dǎo)；但當(dāng)培養(yǎng)基中不含膠體幾丁質(zhì)時(shí)，幾丁質(zhì)酶仍有部分表達(dá)（圖6-a）。以葡萄糖或蔗糖作為碳源時(shí)，發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶含量明顯下降（圖6-b）。

2.3.3緩沖鹽濃度對(duì)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷酸鹽濃度定義為100%，調(diào)整培養(yǎng)基中磷酸鹽相對(duì)濃度至25%～200%不等，比較不同緩沖鹽濃度對(duì)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖7所示。培養(yǎng)基中緩沖鹽濃度為初始培養(yǎng)基緩沖鹽濃度的50%～125%時(shí)，單位體積發(fā)酵液所表現(xiàn)出的幾丁質(zhì)酶活力穩(wěn)定在較高水平；低于或高于該濃度范圍均使幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量有所下降。

2.3.4培養(yǎng)基成分的正交優(yōu)化根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇酵母膏作為氮源，膠體幾丁質(zhì)作為碳源和緩沖鹽濃度一起進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最佳培養(yǎng)基配方。菌體的發(fā)酵均在最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行（含0.2%吐溫80），結(jié)果如表2所示。使用SPSS 10.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后，發(fā)現(xiàn)在α=005的顯著性水平上酵母膏和膠體幾丁質(zhì)的濃度變化顯著影響了幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量（P<0.05）；而培養(yǎng)基中的緩沖鹽濃度的變化對(duì)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響不顯著。此外，極差（R）結(jié)果表明，酵母膏濃度對(duì)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響較大?？疾焐鲜?個(gè)因素在4個(gè)水平上的變化之后，得出最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分為：酵母膏 6.0 g/L，膠體幾丁質(zhì)含量 2.0%，緩沖鹽濃度為初始發(fā)酵培養(yǎng)基的50%。經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，使用該配方后，菌株M64-7酶活穩(wěn)定在（55.19±0.48） U/mL。

2.4溫度與pH值對(duì)發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶活力的影響

溫度與pH值對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響如圖8所示。發(fā)酵液最適催化溫度為60 ℃；當(dāng)反應(yīng)溫度為80 ℃時(shí)，酶活為最高值的41.17%（圖8-a）。圖8-b表明，發(fā)酵液在pH值為70時(shí)表現(xiàn)出了最高酶活力。為了進(jìn)一步研究幾丁質(zhì)酶對(duì)高溫的耐受能力，將發(fā)酵液分別置于20～80 ℃預(yù)處理2 h，在60 ℃以及pH值=7.0的條件下測(cè)定殘余的酶活力，結(jié)果（圖8-c）表明，經(jīng)過(guò)60 ℃預(yù)處理后，其酶活力沒(méi)有受到顯著影響；當(dāng)預(yù)處理溫度提高至80 ℃時(shí)，其酶活力仍為原來(lái)的3775%，具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。

3討論與結(jié)論

側(cè)孢短芽孢桿菌在自然界中常常定殖于水體、土壤以及昆蟲(chóng)的體表，對(duì)鱗翅目、鞘翅目、雙翅目的多種昆蟲(chóng)以及一些線蟲(chóng)具有殺滅作用；該菌還產(chǎn)生與拮抗性有關(guān)的酶和抗生素，抑制多種病原細(xì)菌或真菌的生長(zhǎng)[10]。幾丁質(zhì)酶已被證明是微生物產(chǎn)生真菌拮抗能力的重要原因之一，然而國(guó)內(nèi)尚未對(duì)側(cè)孢短芽孢桿菌中幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量及其影響因素展開(kāi)研究。因此，本試驗(yàn)以前期所篩選的側(cè)孢芽孢桿菌M64為基礎(chǔ)，通過(guò)紫外誘變提高其產(chǎn)酶能力，并探索其產(chǎn)酶的最佳條件與影響因素。該菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最佳培養(yǎng)溫度為37 ℃，最佳酸堿度為pH值=7.0。培養(yǎng)基中碳源和氮源的種類(lèi)與濃度對(duì)幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量有顯著影響。膠體幾丁質(zhì)可以誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶的表達(dá)，葡萄糖等速效碳源對(duì)幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生有明顯的抑制作用。 有機(jī)氮源濃度的提高也有助于菌體合成并分泌幾丁質(zhì)酶。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母膏濃度由2 g/L提高至8 g/L時(shí)，發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶的含量提高了31%。經(jīng)過(guò)紫外誘變與培養(yǎng)條件優(yōu)化之后，突變株發(fā)酵液酶活達(dá)到55.19 U/mL，為初始野生型菌株的2.56倍。酶學(xué)分析表明，菌株M64-7發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，80 ℃預(yù)處理2 h仍具有37.75%的催化活性。Karthik等研究指出，微生物幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度主要介于40～60 ℃之間，耐受溫度平均在50 ℃左右[11]。因此，M64-7所分泌幾丁質(zhì)酶的耐熱性處于較高水平。綜上所述，本研究探索了影響側(cè)孢短芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的幾個(gè)營(yíng)養(yǎng)因素，并顯著提高了幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量，為該菌株在幾丁質(zhì)廢棄物生物轉(zhuǎn)化以及生物拮抗方面的推廣與應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

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