史宗勇++路超++唐中偉++趙成萍++陳衛(wèi)國(guó)++馬艷琴++袁建琴

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.080

摘要：以SD大鼠為試驗(yàn)動(dòng)物模型，分別飼喂含轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因大豆和常規(guī)大豆飼料，以轉(zhuǎn)基因大豆飼料飼喂大鼠為試驗(yàn)組，常規(guī)大豆飼料飼喂大鼠為對(duì)照組，擇期進(jìn)行精子畸變?cè)囼?yàn)、顯性致死試驗(yàn)和致畸試驗(yàn)。結(jié)果表明：試驗(yàn)組和對(duì)照組相比精子畸變率無顯著差異（P>0.05），二者與陽性對(duì)照組差異顯著（P<0.05）；顯性致死試驗(yàn)中試驗(yàn)組與對(duì)照組胚胎死亡率無顯著差異（P>0.05）；致畸試驗(yàn)中2組活胎同性別間的體質(zhì)量、體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)、前肢長(zhǎng)度均無顯著差異，經(jīng)活胎外表檢查、骨骼檢查、內(nèi)臟檢查無畸形。結(jié)果說明，喂食轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因大豆飼料對(duì)大鼠精子畸變、胚胎致死、胎仔畸形無不良影響，不存在生殖毒性。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因大豆；精子畸變；顯性致死；致畸試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： S565.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）10-0286-03

收稿日期：2015-08-13

基金項(xiàng)目：山西省自然科學(xué)基金（編號(hào)：2013011028-2）；山西省科技攻關(guān)基金（編號(hào)：20140311025-3）。

作者簡(jiǎn)介：史宗勇（1970—），男，山西太谷人，碩士，副教授，從事動(dòng)物生理與轉(zhuǎn)基因生物安全的研究。E-mail：zongyongtg@sohu.com。1988年世界第一例轉(zhuǎn)基因大豆誕生[1]，自1996年美國(guó)首次批準(zhǔn)Monsanto（孟山都）公司抗草甘磷轉(zhuǎn)基因大豆商業(yè)化種植19年以來，其種植面積在全球范圍內(nèi)不斷擴(kuò)大，2014年全球轉(zhuǎn)基因大豆種植面積達(dá)0.90億hm2，占當(dāng)年轉(zhuǎn)基因作物總面積1.815億hm2的近50%，更是占全球大豆種植面積的82%[2]。抗除草劑大豆GTS-40-3-2累計(jì)獲得26個(gè)國(guó)家和歐盟28個(gè)成員國(guó)的52次批準(zhǔn)，是全球獲得監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)頻次最多的作物，也是應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)基因作物之一[3]?？钩輨┐蠖笹TS-40-3-2是在Soy-bean A5403大豆中導(dǎo)入從天然農(nóng)桿菌菌系CP4中分離出的具有抗草甘膦功能的EPSPS酶，使植株對(duì)草甘膦不敏感，能夠忍受正常劑量或更高劑量的草甘膦而不被殺死，從而獲得重大效益。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆食用性安全的研究集中在其營(yíng)養(yǎng)成分方面[4-5]，而動(dòng)物試驗(yàn)主要集中在日常行為、臟器系數(shù)、組織病理學(xué)、血液學(xué)和血清化學(xué)等分析，大多數(shù)研究結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因大豆是安全的[6-7]。Qi等以復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因大豆（35 423×40-3-2）喂養(yǎng)SD大鼠90 d后，發(fā)現(xiàn)大鼠的臟器系數(shù)、血常規(guī)和血生化等指標(biāo)存在少數(shù)顯著性差異，但這些差異與轉(zhuǎn)基因成分無關(guān)且變量數(shù)值在正常范圍內(nèi)[8]。由于近年來關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物安全性的深入研究，轉(zhuǎn)基因食品評(píng)價(jià)的實(shí)質(zhì)等同性原則受到質(zhì)疑，從手性D-氨基酸（DAA）角度考量，轉(zhuǎn)基因食品和傳統(tǒng)食品的安全性不實(shí)質(zhì)等同[9-10]，轉(zhuǎn)基因食品的食用安全性受到了社會(huì)和公眾的廣泛關(guān)注。

哺乳動(dòng)物生殖過程中，精子的形成和胚胎的發(fā)育對(duì)外界剌激極為敏感，易受化學(xué)、環(huán)境因素的影響而發(fā)生畸變，而且這些潛在的生殖毒性對(duì)生物個(gè)體和種群的影響是長(zhǎng)期的。當(dāng)前關(guān)于轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因大豆致畸效應(yīng)研究和報(bào)道較少。本試驗(yàn)以SD大鼠為動(dòng)物模型，評(píng)估喂食轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因大豆對(duì)大鼠生殖過程致畸性的影響，進(jìn)而探討轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因大豆的潛在生殖毒性作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

雄、雌各60只30日齡SD大鼠購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，按性別分類組群，分籠飼喂。適應(yīng)性喂食7 d后，各群內(nèi)隨機(jī)取30只，喂食含轉(zhuǎn)基因大豆豆粕加工的飼料（GM組），其余30只喂食含常規(guī)大豆豆粕的飼料（CK組），按國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)喂食，根據(jù)試驗(yàn)進(jìn)程隨機(jī)挑選大鼠進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2飼料

試驗(yàn)用轉(zhuǎn)基因大豆豆粕為孟山都遠(yuǎn)東有限公司抗農(nóng)達(dá)GTS40-3-2大豆加工品，對(duì)照組常規(guī)大豆豆粕為其親本 Soy-bean A5403大豆加工品。轉(zhuǎn)基因豆粕經(jīng)農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（太原）檢測(cè)確認(rèn)含CP4-EPSPS外源基因。大鼠飼料委托山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心加工，2種飼料組成成分配比相同，其中豆粕成分占比20%，除豆粕外其余成分來源一致，飼料經(jīng)檢測(cè)符合GB 149243—2010《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料營(yíng)養(yǎng)成分》要求。

1.3主要試劑與器材

磷酸鹽緩沖液、生理鹽水、甲醇、伊紅、絲裂霉素C（MMC）、乙醇、氫氧化鉀、茜素紅、冰醋酸、甘油、水合氯醛、氫氧化鉀、鮑音（Bouin）氏液；生物顯微鏡、解剖刀、剪刀、鑷子、眼科剪、眼科鑷、單面刀片、注射器等。

1.4方法

1.4.1精子畸變?cè)囼?yàn)取70 d齡體質(zhì)量相近的雄性大鼠共15只，其中CK組10只，平均分為2組，設(shè)為陽性對(duì)照組和正常對(duì)照組，GM組5只設(shè)為試驗(yàn)組。陽性對(duì)照組大鼠腹腔注射絲裂霉素C（MMC）1.1 mg/（kg·d）連續(xù)處理5 d，給藥劑量參照傅劍云等小鼠精子致畸數(shù)據(jù)結(jié)合藥理實(shí)驗(yàn)等效劑量系數(shù)折算法換算確定[11]。正常對(duì)照組和試驗(yàn)組不做任何處理。處理期間和處理后各組仍按試驗(yàn)設(shè)計(jì)分組進(jìn)行飼喂。喂食42 d后頸椎脫臼法處死大鼠，剪開腹腔，分離并摘取雙側(cè)附睪置于生理鹽水中，用剪刀剪碎，用吸管輕輕吹打懸浮液5～6次后靜置3～5 min，用4層擦鏡紙過濾組織碎片，取濾液滴于潔凈載玻片上，均勻推片。晾干后用甲醇固定5 min，伊紅染色1 h，用水輕輕沖洗，干燥后進(jìn)行鏡檢。在高倍鏡下觀察500個(gè)精子的形態(tài)，計(jì)算精子畸變率。精子畸變率=畸變精子數(shù)/總檢測(cè)精子數(shù)×100%。

1.4.2顯性致死試驗(yàn)在CK組、GM組內(nèi)選取70 d齡體質(zhì)量相當(dāng)?shù)拇笫螅拷M選取雌性15只，雄性5只，組內(nèi)按雌雄比3 ∶1交配，下午18：00同籠，次日08：00雌雄分籠，隨即沖洗雌鼠陰道制做涂片檢查精子，以查到精子為受孕0 d，受孕 21 d 剖腹取出即將分娩孕鼠的子宮，辨認(rèn)子宮內(nèi)的活胎、死胎、吸收胎數(shù)。

1.4.3胚胎生長(zhǎng)發(fā)育情況每組隨機(jī)選取顯性致死試驗(yàn)雌性孕鼠3只，稱量胎鼠體質(zhì)量，測(cè)體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)、前肢長(zhǎng)。將胎仔按子宮內(nèi)位置順序編號(hào)。單數(shù)的胎仔放入80%的乙醇溶液中固定5 d，用1%的氫氧化鉀溶液浸泡5 d，至肌肉透明可見骨骼，然后用茜素紅染色3 d至骨骼染成紫色，置于透明液中2 d，做骨骼畸形檢查。編號(hào)雙數(shù)的胎仔放入鮑音（Bouin）氏液中固定10 d后，取出標(biāo)本用自來水洗去固定液，用單面刀片沿口經(jīng)耳做水平切面查口腔；將切下的顱頂部，沿眼球前緣垂直作額狀切面查鼻道；然后沿著眼球正中垂直作第二額狀切面，檢查眼球、腦室；沿眼球后緣垂直作第三額狀切面，檢查腦、腦室。之后沿胸、腹壁中線和肋下緣水平線作“十”字切口，暴露胸腔、腹腔及盆腔內(nèi)的器官，做內(nèi)臟畸形檢查。

2結(jié)果與分析

試驗(yàn)期間，各組試驗(yàn)動(dòng)物活動(dòng)正常，生長(zhǎng)發(fā)育良好，被毛濃密有光澤，未見外觀體征、行為活動(dòng)和飲食方面異常，也未發(fā)生死亡現(xiàn)象。

2.1轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因大豆對(duì)大鼠精子畸變的影響

試驗(yàn)組、對(duì)照組和陽性對(duì)照組在喂食42 d后取附睪精子進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)3組均有畸變精子，由圖1可知，異常精子表現(xiàn)為胖頭、雙頭及無頭等。

將精子鏡檢結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組、正常對(duì)照組與陽性對(duì)照組精子畸變率具有極顯著性差異（P<0.01），說明陽性對(duì)照顯著，結(jié)果成立。試驗(yàn)組和正常對(duì)照組相比，采用t檢驗(yàn)P值為0.147（P>0.05），無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.2顯性致死試驗(yàn)

剖腹取出即將分娩母鼠的子宮，辨認(rèn)子宮內(nèi)的活胎、死胎、吸收胎數(shù)。檢查發(fā)現(xiàn)活胎胎仔完整成形，肉紅色，能自然運(yùn)動(dòng)，對(duì)機(jī)械刺激有運(yùn)動(dòng)反應(yīng)；胎盤較大呈紅色，發(fā)育正常。晚死胎胎仔完整成形、灰紅色、無自然運(yùn)動(dòng)，對(duì)機(jī)械刺激無反應(yīng)；胎盤灰紅色、較小。吸收胎呈暗紫或淺色點(diǎn)塊，不能辨認(rèn)胚胎和胎盤。對(duì)各受孕組統(tǒng)計(jì)分析表明：試驗(yàn)組和正常對(duì)照組平均著床數(shù)（P=0.688）、胚胎死亡率（P=0.994）差異不顯著（表2）。

2.3致畸試驗(yàn)

解剖母鼠子宮逐一詳細(xì)察看，行胎仔外部檢查，發(fā)現(xiàn)全部胎仔外觀檢查正常無畸形。測(cè)量活胎體質(zhì)量、體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)和前肢長(zhǎng)度（圖2），各組按胎仔性別歸類，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，2組間雄性胎仔、雌性胎仔各指標(biāo)t檢驗(yàn)P值全部大于0.05，表明兩組間同性胎仔生長(zhǎng)發(fā)育無顯著差異。

用放大鏡檢查處理好的胎仔骨骼透明標(biāo)本，可見試驗(yàn)組、對(duì)照組均有少數(shù)胸骨、顱骨發(fā)育不全，肋骨、椎骨、四肢骨數(shù)量正常，各骨形態(tài)、大小未見異常。

經(jīng)內(nèi)臟檢查，發(fā)現(xiàn)活胎仔口腔無腭裂、舌缺或分叉；鼻道無擴(kuò)大、單鼻道等畸形；眼球形態(tài)正常成雙；無腦水腫積水，無腦室擴(kuò)大；胸腔、腹腔內(nèi)心臟和呼吸、消化、泌尿、生殖等主要器官數(shù)目、形態(tài)、位置無異常，大小勻稱無異常。內(nèi)臟檢查無畸形。

3討論與結(jié)論

精子畸變?cè)囼?yàn)通過觀察精子形態(tài)的變化，檢測(cè)受試物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物精子形成過程的影響，在可引起生殖細(xì)胞遺傳性損傷的因素作用下，動(dòng)物睪丸產(chǎn)生的畸形精子數(shù)可大量增加，雄性動(dòng)物接觸受試物后精子畸變率的改變，可反映該受試物的生殖毒性和對(duì)生殖細(xì)胞的致突變性。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組精子畸變率2%，處于大鼠的精子正?；兎秶?.8%～3.4%[12]，與對(duì)照組相比亦無明顯差異，表明喂食含轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因大豆飼料不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)大鼠的精子畸形率，與張奕等對(duì)轉(zhuǎn)GL融合蛋白基因大米對(duì)SD大鼠的亞慢性毒性試

驗(yàn)研究的精子畸變結(jié)果[13]一致。本試驗(yàn)精子畸變結(jié)果也與蘆春斌等喂食轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)小鼠精子存活率與畸形率影響的研究結(jié)果[14]相似。

顯性致死試驗(yàn)通過觀察大鼠胚胎死亡情況，檢測(cè)受試物誘發(fā)哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞的染色體畸變，反映受試物對(duì)哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞的致突變性。試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組與對(duì)照組的平均著床數(shù)和胚胎死亡率均無顯著差異，表明CP4-EPSPS基因大豆未導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)大鼠染色體結(jié)構(gòu)異?；蛉旧w數(shù)目變化。蘆春斌等研究也表明，喂食轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)大鼠早期胚胎發(fā)育無不良影響[15]。

致畸試驗(yàn)是應(yīng)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鑒定外來受試物致畸性的試驗(yàn)，母體在孕期如受到可通過胎盤屏障的有害物質(zhì)作用，就會(huì)影響胚胎的正常發(fā)育與器官分化，導(dǎo)致胚胎結(jié)構(gòu)和機(jī)能的缺陷，表現(xiàn)出畸胎，從而檢測(cè)受試物導(dǎo)致胚胎結(jié)構(gòu)畸形及生長(zhǎng)遲緩等毒性作用。參考余夢(mèng)瑤等對(duì)轉(zhuǎn)基因棉籽殼栽培毛木耳安全性評(píng)價(jià)時(shí)采用在動(dòng)物的器官敏感期進(jìn)行染毒的檢測(cè)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行檢測(cè)[16]。試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)胎鼠的形成、發(fā)育、外觀、骨骼及內(nèi)臟等有致畸作用。本試驗(yàn)結(jié)果與張珍譽(yù)等對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因稻谷的研究結(jié)果[17]相同。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，喂食轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因大豆飼料對(duì)雄性大鼠精子畸變、孕鼠胚胎致死、胎仔畸變效應(yīng)無明顯影響，說明轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因大豆對(duì)大鼠無明顯生殖毒性。

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