王倩倩++陳大偉

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.077

摘要：將90羽40周齡海蘭褐蛋雞隨機(jī)分為3組，每組30羽，每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)10羽。采用飲水染毒方式對蛋雞進(jìn)行Cd暴露（50 mg/L）和酵母硒保護(hù)試驗(yàn)（飼料中添加3%酵母硒），試驗(yàn)周期為8周。結(jié)果表明：與對照組比較，Cd組血清E2、P4含量呈類似變化，分別自第2、4周顯著下降（P<0.05）；卵巢組織中SOD活性、GSH-Px活性、GSH含量均顯著或極顯著降低（P<0.05或P<0.01），MDA含量極顯著升高（P<0.01）；Cd組SOD活性下降了3245%（P<0.01），GSH-Px活性下降了26.26%（P<0.01），GSH含量下降了19.83%（P<0.01），MDA含量升高了37.03%（P<0.01）；卵巢Cd含量極顯著升高。超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)Cd組卵巢顆粒細(xì)胞染色質(zhì)邊集、線粒體嵴斷裂、空泡化、微絨毛斷裂等損傷變化。與Cd組相比，Se保護(hù)組血清E2、P4含量自第6周顯著升高，卵巢SOD活性、GSH含量均顯著升高（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.05）。卵巢硒含量極顯著升高，Cd含量差異不顯著，卵巢微絨毛、線粒體、細(xì)胞核等損傷變化輕于Cd組。綜上所述，Cd引起的氧化應(yīng)激是Cd致蛋雞卵巢損傷的重要原因，氧化應(yīng)激引起的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡可能是造成蛋雞血清雌激素水平下降的原因之一。酵母硒通過緩解卵巢組織脂質(zhì)過氧化損傷，減輕Cd對卵巢細(xì)胞微絨毛及線粒體的損傷，對蛋雞Cd暴露引起的卵巢損傷具有一定緩解作用。

關(guān)鍵詞：蛋雞；鎘暴露；酵母硒；卵巢；保護(hù)效應(yīng)

中圖分類號： S858.31文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0278-03

收稿日期：2015-12-09

基金項(xiàng)目：江蘇省家禽科學(xué)研究所博士基金（編號：JQ201201）；江蘇省自然科學(xué)基金（編號：BK20131235）。

作者簡介：王倩倩（1984—），女，江蘇南通人，獸醫(yī)師，主要從事畜禽疾病防控。E-mail：158373585@qq.com。

通信作者：陳大偉，助理研究員。E-mail：ydcdw83@sina.com。鎘（cadmium，Cd）是一種毒性很強(qiáng)的有色重金屬元素，少量Cd持續(xù)進(jìn)入體內(nèi)便可能引發(fā)嚴(yán)重的中毒癥狀，各種動物均能發(fā)生Cd中毒。有關(guān)Cd對肝臟、腎臟、睪丸等器官的毒性研究報道[1-4]較多，但Cd對雌性家禽生殖毒性的研究報道相對較少。Cd作為一種高度可疑的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，已引起人們的廣泛關(guān)注。體外試驗(yàn)表明，Cd可降低大鼠血清中孕酮、雌二醇水平，抑制類固醇合成，可能直接影響顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞的功能[5-6]。

硒是動物必需的一種微量營養(yǎng)物質(zhì)，在體內(nèi)發(fā)揮著多種生物學(xué)效應(yīng)，作為硒蛋白、含硒酶的必要成分在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用，抑制脂質(zhì)過氧化，消除過多自由基，從而保護(hù)生物體的膜結(jié)構(gòu)與功能。近年來研究發(fā)現(xiàn)，硒還具有抗應(yīng)激、提高免疫力、促生長、改善肉質(zhì)、提高動物繁殖能力等重要作用[7-8]。目前應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)的硒主要為亞硒酸鈉等無機(jī)硒，而無機(jī)硒的使用會帶來諸多弊端。與無機(jī)硒相比，來源于植物或富硒酵母的有機(jī)硒具有很多優(yōu)勢，在飼料中添加應(yīng)用毒性較小，具有抗氧化特性及較高的組織沉積率、生物利用率，從而減少對環(huán)境的污染[9]，因此提倡在飼料中添加應(yīng)用有機(jī)硒源的硒。而關(guān)于有機(jī)硒源對蛋雞Cd暴露后卵巢保護(hù)效應(yīng)的研究尚未見報道。

本研究通過飲水染毒進(jìn)行Cd暴露，同時在飼料中添加酵母硒，探討有機(jī)硒對Cd暴露蛋雞體內(nèi)激素、卵巢脂質(zhì)過氧化水平及超微結(jié)構(gòu)、Cd蓄積的影響，旨在觀察Cd對產(chǎn)蛋雞的生殖毒性特點(diǎn)，并為以有機(jī)硒為主的環(huán)保型Cd拮抗劑在蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

氯化鎘（CdCl2）購自國藥集團(tuán)，分析純，含量大于99%；酵母硒（拉曼硒）。試驗(yàn)于農(nóng)業(yè)部家禽品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（揚(yáng)州）生產(chǎn)性能測定站進(jìn)行，試驗(yàn)動物為商品海蘭褐殼蛋雞。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將90羽體質(zhì)量生產(chǎn)性能基本一致的40周齡海蘭褐殼蛋雞隨機(jī)分為3組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)10羽雞。Cd組在飲水中添加Cd 50 mg/L；硒保護(hù)組在飲水中添加Cd 50 mg/L，同時在飼料中添加3%的酵母硒（Cd添加質(zhì)量濃度參考GB 5749—2006《飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》，Cd≤0.05 mg/L，在此限量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上提高1 000倍）；對照組飲用純凈水。根據(jù)NY/T 33—2004《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》中蛋雞的營養(yǎng)需要配制常規(guī)玉米-豆粕型飼糧，作為試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧。經(jīng)測定，該飼糧中Cd含量為（0.065±0.003） mg/kg，酵母硒中硒含量為（2 004±1.24） mg/kg。采用3層全階梯籠養(yǎng)，自由采食和飲水，預(yù)試驗(yàn)期為1周，正式試驗(yàn)期為8周。

1.3指標(biāo)及測定方法

1.3.1性腺激素含量的測定分別于試驗(yàn)第2、4、6、8周末進(jìn)行翅靜脈采血，分離血清，采用化學(xué)發(fā)光法測定血清中E2、P4含量。化學(xué)發(fā)光測定試劑盒購自深圳新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司。

1.3.2卵巢抗氧化指標(biāo)的測定染毒結(jié)束后，將蛋雞頸動脈放血處死；摘取雙側(cè)卵巢，去除蛋黃，準(zhǔn)確稱取0.2 g卵巢組織，加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，于冰浴條件下采用高速電動勻漿機(jī)制備10%組織勻漿；將勻漿液以3 000 r/min離心20 min后取上清。主要測定超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、還原型谷胱甘肽（GSH）含量、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，試劑配制和試驗(yàn)操作均按說明書進(jìn)行。

1.3.3卵巢超微結(jié)構(gòu)觀察迅速采集剛處死蛋雞的卵巢組織，將其切為約1 mm3的小塊，采用新鮮配制的25 g/L戊二醛溶液固定后，常規(guī)制備超薄切片。采用JEM-100CXⅡ型透射電鏡（Philips公司）觀察并拍照。

1.3.4卵巢中Cd、硒含量的測定試驗(yàn)結(jié)束后，以頸動脈放血處死雞并采集卵巢。采用微波消解法處理制備樣品，采用ICP-MS（XseriesⅡ，美國Thermo scientific）法測定樣品中的硒、Cd含量。

1.4數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。采用SPSS 17.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析，采用LSD及Duncans多重比較對各處理間的平均值進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1血清中性腺激素含量

由表1可知，與對照組相比，Cd組E2含量自第4周顯著或極顯著降低（P<0.05或P<0.01），保護(hù)組自第6周顯著降低（P<0.05）。與對照組相比，Cd組E2含量分別降低了6.28%、12.48%、15.30%、17.69%，硒保護(hù)組分別降低了505%、9.70%、10.59%、12.91%。血清中P4含量的變化與E2相似，與對照組相比，Cd組自第4周顯著或極顯著降低（P<0.05或P<0.01），保護(hù)組自第6周顯著降低（P<005）。與對照組相比，Cd組P4含量分別降低了8.82%、1336%、20.94%、20.71%，硒保護(hù)組分別降低了7.14%、769%、12.82%、13.63%。添加酵母硒一定程度上恢復(fù)了Cd引起的血清E2和P4水平的下降。

2.2卵巢組織抗氧化指標(biāo)

由表2可知，與對照組相比，染Cd組和酵母硒保護(hù)組的SOD活性、GSH-Px活性、GSH含量均顯著或極顯著降低（P<0.05或P<0.01），MDA含量顯著或極顯著升高（P<005或P<0.01）；與染Cd組相比，酵母硒保護(hù)組的SOD活性、GSH含量均顯著升高（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.05）。其中，Cd組和保護(hù)組的SOD活性分別低于對照組32.45%、16.81%，GSH-Px活性分別低于對照組2626%、16.07%，GSH含量分別低于對照組19.83%、851%，MDA含量分別高于對照組37.03%、17.07%?？梢?，Cd染毒使卵巢發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，酵母硒通過增強(qiáng)抗氧化酶活性、減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生緩解Cd對蛋雞卵巢的氧化損傷。

2.3卵巢超微結(jié)構(gòu)變化

超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，對照組卵巢細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，線粒體結(jié)構(gòu)清晰完整，卵母細(xì)胞微絨毛排列緊密、結(jié)構(gòu)完整（圖1-A、圖1-D）。Cd組部分卵母細(xì)胞微絨毛散亂、稀疏、斷裂，顆粒細(xì)胞染色質(zhì)邊集，線粒體膜不完整，部分嵴斷裂空泡化（圖1-B、圖1-E）。硒保護(hù)組線粒體結(jié)構(gòu)基本完整，微絨毛排列略顯稀疏，但排列整齊，且較少斷裂（圖1-C、圖1-F）?？梢姡Ｗo(hù)組的損傷程度低于Cd染毒組（圖1中“↑”所示）。

2.4卵巢中Cd和硒含量

由表3可知，與對照組相比，Cd組卵巢中Cd含量極顯著升高，硒含量無顯著差異；硒保護(hù)組硒含量極顯著升高。與Cd組相比，硒保護(hù)組Cd含量略有升高，但差異不顯著，硒含量極顯著升高。添加酵母硒提高了卵巢中硒含量，可能促進(jìn)含硒抗氧化酶活性的提高，但不能減輕Cd在卵巢中的沉積。

3結(jié)論與討論

近年來，Cd的生殖內(nèi)分泌干擾作用引起了人們的廣泛關(guān)注。其中，Cd對孕激素合成的影響已成為研究熱點(diǎn)之一。Cd可降低血清中E2和P4濃度。Paksy等在體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞，向培養(yǎng)液中加入不同濃度的CdCl2溶液，觀察CdCl2對E2和P4的影響；結(jié)果表明，體外給予CdCl2可抑制顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞合成E2和P4[5]。在體試驗(yàn)也表明，Cd可降低大鼠血清內(nèi)E2和P4濃度，并存在劑量效應(yīng)[10-11]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Cd組血清中E2、P4濃度均降低，且隨著染Cd時間的延長呈明顯時間效應(yīng)，這與以往報道基本一致。

氧化應(yīng)激是介導(dǎo)Cd毒性損傷作用的主要原因之一[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，蛋雞Cd暴露后卵巢組織的MDA含量增加，抗氧化酶SOD活性、GSH-Px活性均降低，抗氧化物GSH含量下降，表明Cd引起的蛋雞卵巢損傷同樣與脂質(zhì)過氧化密切相關(guān)。添加酵母硒對Cd引起的卵巢氧化損傷具有一定改善作用，這與在大鼠肝臟中的研究結(jié)果一致，硒通過降低MDA水平、增加抗氧化酶活性來拮抗Cd的毒性損傷[15]。硒保護(hù)組卵巢中硒含量增加，Cd含量與Cd暴露組相當(dāng)，表明同時飼喂酵母不能減少Cd在卵巢中的蓄積；而硒保護(hù)組GSH-Px活性的升高與補(bǔ)硒直接相關(guān)，表明補(bǔ)硒能通過增強(qiáng)組織中GSH-Px活性清除自由基來拮抗Cd的毒性損傷。

進(jìn)一步通過超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，卵泡顆粒細(xì)胞出現(xiàn)以凋亡為主的形態(tài)變化。筆者推斷，血清中E2、P4含量變化可能的原因?yàn)镃d損傷卵巢組織，抑制卵泡發(fā)育，使卵泡閉鎖增加，卵泡內(nèi)膜細(xì)胞、卵泡顆粒細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)均受到損傷。Cd可在卵巢組織中蓄積，可能通過與雌激素受體、孕酮受體等類固醇激素受體結(jié)合介導(dǎo)發(fā)揮其毒性作用，使血清中E2、P4水平降低[16]。

超微結(jié)構(gòu)研究顯示，卵巢組織結(jié)構(gòu)受損，其中微絨毛的變化最為明顯。卵泡中各微細(xì)結(jié)構(gòu)的生理功能及其變化與卵泡發(fā)育存在密切關(guān)系。微絨毛是細(xì)胞表面的特定結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞表面伸出的指狀凸起，能夠使細(xì)胞的表面積增加幾十倍。卵母細(xì)胞通過微絨毛結(jié)構(gòu)與卵泡顆粒細(xì)胞發(fā)生聯(lián)系，從而進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞，獲得養(yǎng)分和信息因子。在發(fā)育階段，卵母細(xì)胞代謝旺盛，微絨毛較多，以便更多吸收顆粒細(xì)胞輸送來的營養(yǎng)物質(zhì)；同時，對來自顆粒細(xì)胞的各種信息因子也最為敏感。如果卵泡細(xì)胞激素分泌發(fā)生變動或營養(yǎng)供應(yīng)受阻，卵泡顆粒細(xì)胞先行退化，隨之微絨毛退化，從而引起卵母細(xì)胞閉鎖[17]。Cd組微絨毛散亂、稀疏，部分?jǐn)嗔?，卵泡顆粒細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)均受到損傷，直接影響E2、P2的分泌；結(jié)合線粒體的結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)一步證明氧化應(yīng)激是Cd暴露引起卵母細(xì)胞損傷的主要原因。

添加酵母硒可緩解Cd暴露引起的產(chǎn)蛋率下降，有效降低Cd暴露引起的卵巢組織脂質(zhì)過氧化損傷，同時提升血清中E2、P4的含量水平，有效改善Cd暴露引起的卵巢細(xì)胞微絨毛、線粒體等超微結(jié)構(gòu)的損傷?？梢姡湍肝赏ㄟ^減緩Cd暴露所致的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)來拮抗Cd對蛋雞卵巢的毒性損傷，飼料中添加酵母硒對Cd所致蛋雞卵巢毒性損傷具有一定的保護(hù)效果。

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