陳然++方祖凱++李黎++胡奎++牛俊凡++李俊凱

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.048

摘要：為合成N-芐氧羰基（Cbz）-氨基酸-霉靈，并測(cè)定新化合物的室內(nèi)殺菌活性。采用N，N′-環(huán)己基碳二亞胺（DCC）和[4-（N，N-二甲氨基）吡啶]（DMAP）形成的脫水縮合體系，N-芐氧羰基氨基酸和霉靈發(fā)生縮合反應(yīng)生成13個(gè)新化合物。采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定各化合物對(duì)小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）和棉花枯萎病菌（F. oxysporum）的殺菌活性。N-芐氧羰基-丙氨酸-霉靈、N-芐氧羰基-脯氨酸-霉靈、N-芐氧羰基-苯丙氨酸-霉靈、N-芐氧羰基-甲硫氨酸-霉靈對(duì)小麥赤霉病菌的抑制中濃度（EC50）分別為0.264、0.212、0.225、0.205 mmol/L，低于對(duì)照藥劑霉靈的抑制中濃度（0.338 mmol/L）；N-芐氧羰基-脯氨酸-霉靈、N-芐氧羰基-苯丙氨酸-霉靈、N-芐氧羰基-甲硫氨酸-霉靈對(duì)棉花枯萎病菌的抑制中濃度分別為0.234、0.277、0.289 mmol/L，低于對(duì)照藥劑霉靈的抑制中濃度（0.479 mmol/L）。合成的衍生物均保持了霉靈的生物活性，具有雜環(huán)、苯環(huán)或雜原子的氨基酸結(jié)構(gòu)能夠增加衍生物的活性。

關(guān)鍵詞：N-芐氧羰基-氨基酸-霉靈；合成；殺菌活性；小麥赤霉??；棉花枯萎病

中圖分類號(hào)： S482.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）10-0185-04

收稿日期：2015-09-10

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30971948；31371976）。

作者簡(jiǎn)介：陳然（1990―），男，湖北洪湖人，碩士。E-mail：changdachenran@163.com。

通信作者：李俊凱，博士，教授，主要從事新農(nóng)藥開(kāi)發(fā)與農(nóng)藥環(huán)境毒理研究。E-mail：junkaili@sina.com。霉靈（hymexazol）是一種內(nèi)吸性殺菌劑和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[1]，主要用作拌種、拌土或隨水灌溉。霉靈在植物體內(nèi)經(jīng)代謝可產(chǎn)生2種糖苷，被植物吸收后可提高作物的生理活性，如促進(jìn)植株生長(zhǎng)、根分蘗、根毛增加、提高根的活性。在土壤中，霉靈可降解成毒性很低、對(duì)土壤中的微生物生態(tài)無(wú)影響、對(duì)環(huán)境安全的化合物[2-4]。

氨基酸類農(nóng)藥可以作為除草劑[5]、殺蟲(chóng)劑[6]、殺菌劑[7]和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[8]。由于氨基酸類農(nóng)藥化學(xué)結(jié)構(gòu)選用了自然界本身存在的氨基酸結(jié)構(gòu)，并且自然界存在著相應(yīng)的可分解它們的微生物群，因此這類農(nóng)藥容易被分解而不易造成殘留污染[9]，而且降解后的氨基酸還能作為植物生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)劑，對(duì)農(nóng)作物有較好的增產(chǎn)效果[10]。氨基酸酯類農(nóng)藥是氨基酸類農(nóng)藥之一。Boesenberg等報(bào)道了一些分子結(jié)構(gòu)中含鹵代芳環(huán)且具有除草活性的氨基酸酯類衍生物，如N-?；被狨?、苯并唑基氨基酸酯、苯并噻唑基氨基酸酯等[11]。Chen等合成了一系列含氮芥、磷、硫及苯環(huán)的氨基酸酯類衍生物，發(fā)現(xiàn)其具有良好的除草和殺菌活性[12]。

研究表明，將活性農(nóng)藥分子與氨基酸進(jìn)行耦合，不僅可以得到具有一定活性的新化合物，而且還可以大大改善農(nóng)藥的傳導(dǎo)性[13]。基于氨基酸類農(nóng)藥的優(yōu)點(diǎn)以及霉靈的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，筆者將霉靈和不同種類的氨基酸進(jìn)行拼接，合成一系列未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的N-芐氧羰基-氨基酸-霉靈，以期為提高霉靈的殺菌活性，并擴(kuò)大霉靈的殺菌譜提供理論指導(dǎo)?；衔锖铣陕肪€見(jiàn)圖1。

1材料與方法

1.1供試材料

小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）；棉花枯萎病菌（F. oxysporum），均由長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院病理研究室提供。

97%霉靈原藥，淄博德樽貿(mào)易有限公司；95%氯甲酸芐酯（Cbz-Cl）、N，N′-環(huán)己基碳二亞胺、4-（N，N-二甲氨基）吡啶等試劑為市售分析純；L-甘氨酸（Gly）、L-丙氨酸（Ala）、L-纈氨酸（Val）、L-亮氨酸（Leu）、L-異亮氨酸（Ile）、L-脯氨酸（Pro）、L-苯丙氨酸（Phe）、L-色氨酸（Trp）、L-甲硫氨酸（Met）、L-蘇氨酸（Thr）、L-絲氨酸（Ser）、L-酪氨酸（Tyr）、L-組氨酸（His）等氨基酸為市售生化試劑。

LABOROTA4003型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)）、Bruker600型核磁共振儀（德國(guó)）、WRR熔點(diǎn)測(cè)定儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、EA3000元素分析儀（意大利利曼有限公司）、ZF-2型三用紫外分析儀（上海市安亭電子儀器廠）、85-2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂(lè)儀器有限公司）、SPX-80-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）。

1.2化合物的合成

1.2.1N-Cbz-氨基酸的合成通法[14] 稱取0.05 mol氨基酸和0.05 mol（5.3 g）無(wú)水碳酸鈉于250 mL圓底燒瓶中，加入200 mL水溶解。冷卻至-5 ℃，緩慢滴入0.06 mol（10235 g）氯甲酸芐酯，滴加完畢后緩慢升溫至室溫，反應(yīng) 5 h。反應(yīng)體系用乙醚洗滌（60 mL），棄乙醚層；水相用 6 mol/L 的鹽酸調(diào)pH值至1，然后用乙酸乙酯萃?。?0 mL），飽和氯化鈉水溶液洗滌（40 mL）有機(jī)相至中性，加入無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾濃縮得粗品。用乙醚 ∶甲苯（1 ∶1）溶解粗品，石油醚重結(jié)晶得目標(biāo)產(chǎn)物Ⅰa-m。

1.2.2N-Cbz-氨基酸-霉靈的合成通法參考文獻(xiàn)[15-17]方法。稱取0.03 mol N-芐氧羰基-氨基酸（Ⅰ）于150 mL圓底燒瓶中，加入50 mL乙腈，待完全溶解后，分別加入0035 mol（3.470 g）霉靈和0.35 g 4-（N，N-二甲氨基）吡啶，充分溶解后冷卻至-5 ℃。稱取0.035 mol（7.222 g）N，N′-環(huán)己基碳二亞胺于燒杯中，加入50 mL乙腈溶解，冰浴條件下緩慢滴入上述燒瓶中，冰浴下攪拌1 h后緩慢升溫至室溫，薄層色譜，跟蹤至反應(yīng)結(jié)束。過(guò)濾、濃縮，柱層析純化得目標(biāo)產(chǎn)物Ⅱa-m。

1.3殺菌活性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率抑制法[18]，以霉靈為對(duì)照藥劑，測(cè)定目標(biāo)化合物對(duì)小麥赤霉病菌和棉花枯萎病菌的室內(nèi)殺菌活性。將供試藥液配制成0.1～1.6 mmol/L之間的梯度濃度，設(shè)3次平行試驗(yàn)。小麥赤霉病菌培養(yǎng)54 h、棉花枯萎病菌培養(yǎng)70 h后，采用十字交叉法測(cè)定各藥劑處理和空白對(duì)照的菌落直徑，取平均值后，按公式（1）計(jì)算各藥劑對(duì)病原菌的生長(zhǎng)抑制率，將菌絲生長(zhǎng)抑制率換算成抑制概率值Y，藥劑濃度換算成濃度對(duì)數(shù)X。按濃度對(duì)數(shù)與概率值回歸法求得不同化合物對(duì)小麥赤霉病菌和棉花枯萎病菌的毒力公式y(tǒng)=a+bx，并由毒力公式計(jì)算各藥劑抑制中濃度（EC50）。

抑制生長(zhǎng)率=空白對(duì)照組菌落直徑-藥劑處理組菌落直徑空白對(duì)照組菌落直徑-打孔器內(nèi)徑×100%。（1）

2結(jié)果與分析

2.1結(jié)構(gòu)鑒定

化合物的理化性質(zhì)和元素分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，核磁共振氫譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

2.2殺菌活性

從表3可知，目標(biāo)化合物對(duì)這2種供試病原菌均有很好的活性，部分化合物與霉靈的活性相近。不同的氨基酸結(jié)構(gòu)對(duì)衍生物的活性影響有差異，其中，氯甲酸芐酯保護(hù)的丙氨酸（Ⅱb）、脯氨酸（Ⅱf）、苯丙氨酸（Ⅱg）和甲硫氨酸（Ⅱi）與霉靈的耦合物，對(duì)小麥赤霉病菌的活性均顯著高于霉靈本身；氯甲酸芐酯保護(hù)的脯氨酸（Ⅱf）、苯丙氨酸（Ⅱg）和甲硫氨酸（Ⅱi）與霉靈的耦合物對(duì)棉花枯萎病菌的活性均高于霉靈。

3結(jié)論與討論

本研究以霉靈和氨基酸為原料，采用N，N′-環(huán)己基碳二亞胺脫水縮合衍生合成的方法，合成了13個(gè)未見(jiàn)報(bào)道的 N-芐氧羰基-氨基酸-霉靈，所有化合物的結(jié)構(gòu)均通過(guò)核磁共振氫譜和元素分析的確認(rèn)，該反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物純化處理簡(jiǎn)單。初步的生物活性測(cè)定結(jié)果表明，目標(biāo)化合物不僅保留了霉靈原有的殺菌活性，而且接入不同氨基酸的結(jié)構(gòu)對(duì)衍生物活性影響存在差異，其中含雜環(huán)、苯環(huán)或雜原子的脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸的衍生物活性優(yōu)于其他氨基酸衍生物。氨基酸是自然界的重要物質(zhì)，具有重要的生理功能[19]，其本身具有殺蟲(chóng)、殺菌和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用[20-21]。另外，在細(xì)胞膜上存在大量氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)載體[22]，這些載體協(xié)助氨基酸進(jìn)入細(xì)胞，并能增加氨基酸在生物體內(nèi)的運(yùn)轉(zhuǎn)。農(nóng)藥分子與氨基酸基團(tuán)耦合后，如果沒(méi)有屏蔽氨基酸與其載體的結(jié)合部位，在一定程度上仍然可以與其載體結(jié)合，從而增加生物體對(duì)耦合物的吸收，并有可能改善耦合物在生物體內(nèi)的傳導(dǎo)，從而提高耦合物的殺菌活性。

Xu等將谷氨酸與拌種靈耦合后，施用于煙草植株的中部葉片，在植株頂端和根部都檢測(cè)到了該衍生物，且在植株頂端有一定的積累性，說(shuō)明拌種靈與谷氨酸耦合后傳導(dǎo)性得到了改善[23]。本試驗(yàn)合成的霉靈-氨基酸衍生物在植物體內(nèi)是否具有類似的傳導(dǎo)性，以及傳導(dǎo)性與氨基酸種類之間是否具有相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究。

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