doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.046

摘要：希金斯炭疽菌侵染菜心、蘿卜等十字花科植物引起炭疽病，給各國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失?；卺劸平湍傅湫偷牧姿峒〈继禺愋粤字窩（PI-PLC）序列，利用Blastp以及關(guān)鍵詞對該菌蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對、搜索，以及通過SMART分析，明確該菌存在8個典型的PI-PLC序列；通過生物信息學(xué)分析，明確上述PI-PLC序列在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)組成、信號肽等方面均具有一定差異。遺傳關(guān)系比較分析明確該菌中的PI-PLC序列與禾谷炭疽菌（Colletorichum graminicola）、松針炭疽菌（C. fioriniae）等炭疽菌屬中的病菌具有較近的親緣關(guān)系。

關(guān)鍵詞：希金斯炭疽菌；磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C；亞細胞定位；二級結(jié)構(gòu)；炭疽菌屬

中圖分類號：S432.4文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0177-04

收稿日期：2015-08-28

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31560211）；云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點實驗室開放基金（編號：ZK150004）；云南省優(yōu)勢特點重點學(xué)科生物學(xué)一級學(xué)科建設(shè)項目（編號：50097505）；云南省高校林下生物資源保護及科用科技創(chuàng)新團隊項目（編號：2014015）；云南省教育廳科學(xué)研究基金（編號：2014Y330）。

作者簡介：韓長志（1981—），男，河北石家莊人，博士，講師，主要從事經(jīng)濟林木病害生物防治與真菌分子生物學(xué)研究。Tel：（0871）63862918；E-mail：hanchangzhi2010@163.com。植物與病原菌互作過程中，眾多細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與其中，現(xiàn)已明確G蛋白信號途徑及其下游的MAPK信號傳導(dǎo)途徑和cAMP信號傳導(dǎo)途徑具有重要的作用。因此，學(xué)術(shù)界關(guān)于真菌RGS的研究產(chǎn)生了較多成果[1]，磷酸肌醇特異性磷脂酶C（PI-PLC）的一種異構(gòu)體PI-PLC β為磷脂肌醇信號途徑PKC系統(tǒng)中的重要效應(yīng)物[2]，可以將4，5-二磷酸磷脂酰肌醇水解為三磷酸肌醇和二酰甘油，而上述分子均作為細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使，發(fā)揮著重要作用。

希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）可以侵染菜心、蘿卜等十字花科蔬菜引起炭疽病，該菌現(xiàn)主要分布于美國、日本、印度等國家[3-5]，在我國，由該菌侵染菜心引起的炭疽病成為影響菜心產(chǎn)量和品質(zhì)的重要危害之一[6]。國內(nèi)外對該菌的研究主要集中在病菌的生物學(xué)特性[7]、生防菌篩選[8]、遺傳轉(zhuǎn)化[9-10]以及不同營養(yǎng)元素（硅、氮、鉀等）[11-14]、外源酚酸類物質(zhì)pHBA[15]控制病害等方面，同時，隨著該基因組序列的釋放[16]，林春花等對其開展了MAPK途徑相關(guān)基因的找尋及信號通路簡圖的繪制工作[17]，韓長志對其進行了RGS[18]、14-3-3[19]、septin[20]、AC、PITP等蛋白生物信息學(xué)分析。此外，對于該菌致病基因的研究，建立根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)及直接重復(fù)重組介導(dǎo)的基因打靶等技術(shù)[9-10]。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)黃俊斌教授實驗室建立了希金斯炭疽菌轉(zhuǎn)化子的突變體庫，為進一步對這些轉(zhuǎn)化子基因功能研究提供了技術(shù)支持[21-22]。然而，對于該菌中存在的PI-PLC數(shù)量、功能尚不清楚。本研究利用釀酒酵母S288c（Saccharomyces cerevisiae S288c）中已經(jīng)報道的PI-PLC氨基酸序列，通過在炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行Blastp比對分析[23]，以及通過關(guān)鍵詞搜索，獲得與釀酒酵母PI-PLC同源的希金斯炭疽菌序列，并通過保守結(jié)構(gòu)域分析、疏水性分析、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測位等生物信息學(xué)分析以及遺傳關(guān)系分析，以期為進一步開展希金斯炭疽病菌的研究提供重要的指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1材料

根據(jù)釀酒酵母S288c中含有的1個PI-PLC氨基酸序列，利用炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫在線Blastp比對，同時通過輸入“phosphatidylinositol-specific Phospholipase”“Phospholipase C”“PLC”關(guān)鍵詞在上述數(shù)據(jù)庫中進行檢索PLC（表1）。

1.2方法

1.2.1保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測利用SMART網(wǎng)站[24]在線分析 PI-PLC所具有的保守結(jié)構(gòu)域特征。

1.2.2蛋白質(zhì)疏水性預(yù)測利用Protscale程序[25]對PI-PLC進行疏水性測定。

1.2.3蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運肽及信號肽預(yù)測對蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運肽的預(yù)測利用TargetP 1.1 Server在線分析實現(xiàn)[26]，信號肽的預(yù)測則是利用SignalP 3.0 Server[27]在線分析實現(xiàn)。

1.2.4蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用PHD[28]在線分析實現(xiàn)，利用TMHMM Server v. 2.0[27]實現(xiàn)PI-PLC的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2.5亞細胞定位分析利用ProtComp v 9.0實現(xiàn)PI-PLC的亞細胞定位分析[29]。

1.2.6系統(tǒng)進化樹構(gòu)建在NCBI中，以希金斯炭疽菌中所含PI-PLC氨基酸序列為基礎(chǔ)，在線進行Blastp同源搜索，獲得來自不同物種的同源蛋白質(zhì)序列。對所獲得的同源序列，利用ClustalX[30]進行多重比對分析，隨后利用 MEGA 5.2.2 軟件[31]構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2結(jié)果與分析

2.1希金斯炭疽菌中8個PI-PLC均具有典型的PLCXc或者PLCYc保守結(jié)構(gòu)域

通過Blastp比對分析，共獲得10個同源序列，同時，利用3個關(guān)鍵詞搜索，分別獲得8、9、7個蛋白序列，對上述蛋白進行整理、去除重復(fù)，共獲得9個蛋白，其ID分別為CH063_08309.1、CH063_07411.1、CH063_07011.1、CH063_05432.1、CH063_04045.1、CH063_03075.1、CH063_02624.1、CH063_00149.1、CH063_00100.1（表1）。其中，發(fā)現(xiàn)一個蛋白序列（CH063_04045.1）僅可以通過Phospholipase-C搜索到，不能通過“phosphatidylinositol-specific Phospholipase”“PLC”搜索到，該蛋白通過Blastp也未能比對到，有待于進一步核實；隨后，利用SMART在線分析，結(jié)果顯示，僅有8條序列具有典型的PLCXc保守域結(jié)構(gòu)，同時還具有諸如PLCYc、C2等保守結(jié)構(gòu)域（圖1）。

對CH063_04045.1進行深入分析，明確該蛋白為肌醇鞘磷脂磷脂酶C，并不是G蛋白下游的效應(yīng)因子，同時，基于SMART分析，該蛋白并不含有磷脂酶所含有的保守PLCXc或者PLCYc結(jié)構(gòu)域，因此將該蛋白排除。根據(jù)上述分析，共獲得8條蛋白序列，依據(jù)其氨基酸大小進行排序，分別將其命名為ChPLC1、ChPLC2、ChPLC3、ChPLC4、ChPLC5、ChPLC6、ChPLC7、ChPLC8（表1）。

2.2ChPLC2具有典型的信號肽區(qū)域

通過SignalP分析，除ChPLC2在N端含有1個典型信號肽序列外，其他PI-PLC均不含有信號肽；同時，通過TMHMM分析，除ChPLC2在N端含有1個跨膜結(jié)構(gòu)域外，其他PI-PLC均不含有跨膜結(jié)構(gòu)域（圖1），鑒于TMHMM不能將蛋白中所含的信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)域嚴(yán)格區(qū)分，因此，ChPLC2在N端含有的序列結(jié)構(gòu)是信號肽，而不是由TMHMM、SMART程序所預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域（圖1）。

2.3希金斯炭疽菌PI-PLC均為親水性蛋白

通過疏水性分析，明確ChPLC1和ChPLC2、ChPLC3和ChPLC6、ChPLC4和ChPLC5在疏水性最強氨基酸殘基上相同，分別為L、I、V；ChPLC1和ChPLC8、ChPLC4和ChPLC6在親水性最強氨基酸殘基上相同，分別為R、E（表2）。盡管如此，其他PI-PLC彼此之間在親（疏）水性最強氨基酸殘基及位置方面仍然存在較大的差異（表2、圖2），推測在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，PI-PLC所具有的功能存在一定的差異性。

2.4二級結(jié)構(gòu)分析

明確8個PI-PLC均含有無規(guī)卷曲、α-螺旋以及β-轉(zhuǎn)角，所占比例不盡相同。就所含的無規(guī)卷曲比例而言，ChPLC2最低，為17%，ChPLC8最高，為45%，其他PI-PLC所含比例集中于20%～35%；就所含的α-螺旋而言，ChPLC1最低，為5%，ChPLC7最高，為41%，其他PI-PLC所含比例集中于20%～40%；就β-轉(zhuǎn)角而言，ChPLC3最低，為5%，ChPLC1最高，為44%，其他PI-PLC所含比例集中于5%～25%（圖3）。

2.5轉(zhuǎn)運肽及亞細胞定位分析

轉(zhuǎn)運肽分析結(jié)果顯示，除ChPLC2明確定位于分泌途徑，ChPLC1、ChPLC4、ChPLC7定位于線粒體，其他PI-PLC定位在任何位置（表3）。為了更好地明確PI-PLC的亞細胞定位，利用ProtComp進行分析，結(jié)果顯示，ChPLC1、ChPLC7定位于線粒體，這與通過TargetP預(yù)測結(jié)果相同，ChPLC2定位于細胞膜，ChPLC3、ChPLC6定位于細胞核，ChPLC4、ChPLC5、ChPLC7定位于細胞質(zhì)中（數(shù)據(jù)未顯示）。上述定位預(yù)測結(jié)果說明希金斯炭疽菌中數(shù)量眾多的PI-PLC定位情況不盡相同，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著不同的功能。

2.6遺傳關(guān)系分析

通過在NCBI中對PI-PLC進行Blastp比對，獲得與希金斯炭疽菌PI-PLC的同源序列，選擇炭疽菌屬真菌其他序列進行遺傳關(guān)系分析。結(jié)果顯示，就物種之間關(guān)系而言，該菌中的PI-PLC與禾谷炭疽菌、松針炭疽菌親緣關(guān)系較近；就該菌中的PI-PLC之間的關(guān)系而言，8個PI-PLC可以大致聚為五大類，具體而言，ChPLC6、ChPLC5、ChPLC7關(guān)系較近，為一類；ChPLC3與ChPLC1關(guān)系較近，為一類；ChPLC8、ChPLC4、ChPLC6各為一類。

3結(jié)論與討論

隨著希金斯炭疽菌全基因組序列的釋放[16]，為深入解析該菌致病因子研究提供了重要的數(shù)據(jù)支撐，一些涉及G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上的重要效應(yīng)物[18，32]以及MAPK途徑上的重要蛋白得到進一步明確[17]。本研究基于前人研究成果，明確了該菌中存在7個典型的PI-PLC，初步明確了上述蛋白具有典型的PLCXc、PLCYc、C2等保守結(jié)構(gòu)域、均為親水性蛋白等特點。盡管如此，希金斯炭疽菌中8個PI-PLC彼此之間在亞細胞定位、信號肽、二級結(jié)構(gòu)組成方面存在一定差異，推測上述蛋白在不同位置發(fā)揮不同作用，同時，對上述PI-PLC與其他物種進行遺傳關(guān)系分析，明確希金斯炭疽菌與松針炭疽菌親緣關(guān)系較近，為進一步深入研究其他炭疽菌屬真菌PI-PLC打下堅實的理論基礎(chǔ)。通過深入解析希金斯炭疽菌中G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的致病因子，有助于為開發(fā)用于以G蛋白信號通路為作用靶標(biāo)的化學(xué)藥劑提供重要的理論意義。

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