薛鵬飛++柳鵬福++史吉平++李麗霞

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.020

摘要：通過構建鹽單胞菌Fosmid基因組文庫，以求篩選到群體感應淬滅酶（AHL降解酶）。采用改良的SDS-CTAB法提取1株鹽單胞菌基因組DNA，經平末端連接、包裝和轉染后，成功構建鹽單胞菌Fosmid基因組文庫。該文庫庫容1 700個克隆，平均插入片段約35 kb，共包含約60 Mb的DNA容量，覆蓋該菌基因組10倍以上。然后以加 X-gal的MM基本培養(yǎng)基篩選AHL降解酶陽性克隆，對文庫進行功能驅動的藍白斑篩選。通過初篩，篩選到3個Fosmid陽性克隆，證實了所構建的Fosmid基因組文庫能夠應用于AHL降解酶的活性篩選。同時該Fosmid文庫亦可進一步用于其他功能基因的開發(fā)。

關鍵詞：鹽單胞菌；Fosmid基因組文庫；藍白斑篩選；群體感應淬滅酶

中圖分類號： Q785文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0088-04

收稿日期：2015-10-11

基金項目：國家自然科學基金（編號：41306142）。

作者簡介：薛鵬飛（1991—），男，河北南和人，碩士研究生，從事海洋環(huán)境中群體感應淬滅酶資源發(fā)掘及酶學性質相關研究。E-mail：xpflying@yeah.net。

通信作者：李麗霞，副教授，主要從事植物逆境生理與分子生物學、植物蛋白質組學和海洋藻類生態(tài)毒理學等研究。植物的細菌性病害是威脅農業(yè)生產的主要自然災害之一。病害的發(fā)生往往造成作物大面積減產，并在農產品貯藏、加工、運輸過程中進一步造成更大危害，帶來巨大損失。目前主要采用化學藥物來防治細菌性病害。這些化學藥物的使用顯著減輕了病害的危害程度，減少了經濟損失，但也帶來了環(huán)境污染、細菌耐藥性增加及化學藥物殘留等諸多問題。近年來，隨著對環(huán)保意識的提高，人們越來越崇尚自然健康的生活方式，對植物病害的防治也提出了更高的要求，生物防治日益受到重視。

很多植物病原菌的致病性受一種被稱為群體感應（quorum sensing，QS）系統(tǒng)的機制調控 [1]。很多病原菌的致病能力受群體感應系統(tǒng)調控[2-4]，也能被群體淬滅（quorum quenching，QQ）機制干擾和減弱。以細菌群體感應系統(tǒng)為靶標的群體淬滅已被證明是防治這一類細菌性病害的有效策略。具有群體淬滅功能的信號分子降解酶能水解信號分子，進而干擾致病基因的表達，起到防治病害的作用[5]。2000年，Dong等篩選到1株能特異性降解AHL類信號分子的芽孢桿菌（Bacillus sp.）240B1，并從中分離到aiiA基因，將其轉入致病菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora）SCG1后，顯著減少了后者AHL類信號分子的產生，降低了其對馬鈴薯、胡蘿卜等的致病性。將該基因轉入煙草、馬鈴薯后，這些植物對胡蘿卜軟腐歐文氏菌SCG1導致的軟腐病抗性大大增強[6]。從第1個內酯酶AiiA被發(fā)現(xiàn)至今，已有約20種內酯酶基因得到了克隆與鑒定。篩選有實際應用價值的高活性信號降解酶是目前生物防治領域的研究熱點之一。

目前，穩(wěn)定的大片段基因組文庫可以作為研究基因組學及功能基因的重要材料[7]。Fosmid 載體是現(xiàn)在流行的用于替代Cosmid載體構建大片段文庫的新載體。與BAC文庫構建相比，F(xiàn)osmid文庫的構建更簡單、快速，可利用其進行全基因組物理圖譜構建、研究基因功能和表達調控、重要性狀基因的圖位克隆和基因結構及功能分析等。Fosmid文庫中重組載體在宿主菌中以單拷貝形式存在，穩(wěn)定性好，需要時可誘導達到高拷貝；且其隨機性好，保證了每段DNA在文庫中出現(xiàn)的頻率均等。近年來，F(xiàn)osmid文庫已被廣泛應用于基因圖位克隆、物理圖譜的構建、比較基因組及功能基因的篩選與研究。

本實驗室分離了大量細菌，并從中篩選出一系列具有信號分子降解活性的細菌，鑒定后發(fā)現(xiàn)其中有1株鹽單胞菌1A01339（Halomonas salaria）首次被發(fā)現(xiàn)具有信號降解的活性。本研究對該菌株構建合格的Fosmid基因組文庫。利用實驗室構建的高通量篩選平臺，通過功能驅動的藍白斑篩選得到Fosmid陽性克隆，以期為后續(xù)分離純化該群體感應淬滅酶及深入研究其酶學性質和催化機制奠定基礎。同時該文庫可用于其他功能基因的開發(fā)與研究。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源鹽單胞菌1A01339（Halomonas salaria）購自于中國海洋微生物菌種保藏管理中心，經鑒定具有群體感應淬滅活性；根癌農桿菌NTI（traR；tra：：lacZ749）由本實驗室保存。

1.1.2主要試劑和儀器溶菌酶、蛋白酶K、Not Ⅰ購自Thermo Scientific公司；λ/Hind Ⅲ Digest DNA Marker低熔點瓊脂糖酶β-Agarase購自于TaKaRa公司；文庫構建試劑盒Copy Control Fosmid Library Production Kit、大腸桿菌EPI300-T1購自Epicentre公司；小劑量質粒提取試劑盒購自于Axygen公司；X-gal、IPTG、OOHL（3-oxo-C8-HSL）購自Sigma公司；核酸電泳儀、紫外凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-RAD）；各型規(guī)格移液器、小型離心機（Eppenendorf）；恒溫培養(yǎng)箱 （上海智城分析儀器）；純水制備系統(tǒng)（Milipore）。

1.1.3主要培養(yǎng)基高鹽LB培養(yǎng)基：含3%質量濃度NaCl的LB培養(yǎng)基；篩選培養(yǎng)基：加有20 mg/mL X-gal的1.5%質量濃度瓊脂固體MM基本培養(yǎng)基，所用抗生素終濃度為卡那霉素50 μg/mL。

1.2鹽單胞菌Fosmid文庫的構建及鑒定

1.2.1鹽單胞菌基因組DNA的提?。ǜ牧糞DS-CTAB法）為了能順利獲得較為完整的鹽單胞菌基因組，本研究采用改良的SDS-CTAB法提取。具體操作步驟如下：挑取鹽單胞菌1A01339接種于50 mL高鹽LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)；取1.5 mL上述菌液于2 mL離心管中，8 000 r/min離心3 min，棄去上清；菌體洗滌2次，5 000 r/min離心5 min，棄去上清；加入564 μL的TE重置懸浮，然后加入約10 μg溶菌酶，輕輕混勻，37 ℃溫育1 h；再加入50 μL 10% SDS和 3 μL 蛋白酶K（10 mg/mL），輕輕混勻，37 ℃溫育2 h；加入100 μL 5 mol/L NaCl，混合均勻，65 ℃反應2 min；加入80 μL CTAB-NaCl，混合均勻，65 ℃反應10 min；加入等體積的氯仿-異戊醇（24 ∶1），振蕩均勻，9 000 r/min離心10 min；上清移至另一離心管中加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25 ∶24 ∶1），輕輕混勻，10 000 r/min離心10 min；上清移至另一離心管加入0.6倍體積異丙醇（貼壁加入），輕輕顛倒混勻，靜置10 min，9 000 r/min 離心5 min；棄上清，用70%乙醇洗滌2次，10 000 r/min 離心5 min；離心管倒立于鋪開的紙巾上，數(shù)分鐘后，直立離心管，干燥DNA；干燥DNA溶于 50 μL TE中。-20 ℃保存。

1.2.2基因組Fosmid文庫的構建研究依照Copy Control Fosmid Library Production Kit說明構建Fosmid文庫。因為構建Fosmid基因組文庫所需要的最合適的DNA大小范圍為 30～40 kb，所以需將將大片段的高質量基因組DNA隨機剪切成大小均勻的片段（控制在25～40 kb之間）。為保證對基因組DNA處理的隨機性，本研究未使用限制性內切酶進行處理。采用200 μL小孔徑Tip反復吹吸50、100、150、200、250次，通過調整吹吸次數(shù)來獲得最合適的DNA片段。電壓 30～35 V電泳過夜，檢測隨機剪切程度，切下30～40 kb相應區(qū)間片段，用低熔點瓊脂糖酶 β-Agarase對DNA片段進行消化回收。利用End-Repair Enzyme將DNA片段進行平末端處理和5′磷酸化修飾。利用連接酶Fast-Link DNA Ligase將獲得的DNA片段連接于Fosmid黏粒載體上。連接液用噬菌體蛋白λ Packaging Extracts包裝，加入氯仿輕柔混勻，包裝液經梯度稀釋后侵染宿主EPI300-T1感受態(tài)細胞，確定合適的稀釋比例。以經過適當稀釋的包裝液侵染宿主EPI300-T1感受態(tài)細胞，37 ℃孵育1 h。最后將包裝完成的菌液涂布于含12.5 μg/ mL氯霉素的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)過夜，構建成Fosmid基因組文庫。

1.2.3文庫重組克隆子的鑒定插入片段大小鑒定：在平板上隨機挑取14個克隆子培養(yǎng)并根據Fosmid文庫構建說明加入多拷貝誘導液對其進行誘導培養(yǎng)，使其獲得高拷貝數(shù)質粒。采用Axygen質粒提取試劑盒提取質粒，Not Ⅰ酶切，如上條件進行低電壓普通電泳，檢測插入片段的大小分布情況，鑒定Fosmid文庫質量。克隆穩(wěn)定性檢測：隨機挑取5個克隆，分別接種于3 mL含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)5 d，分別提取第50代（培養(yǎng)3 d）和第100代（培養(yǎng)5 d）菌液中的質粒，Not Ⅰ酶切后，電泳檢測。

1.2.4Fosmid文庫保存（1）短期保存：Fosmid文庫克隆在平板上培養(yǎng)后可暫時保存1～2個月。（2）長期保存：用無菌牙簽挑取轉化平板上的單菌落于96孔培養(yǎng)板中，每個菌落1個孔格，每孔加入含氯霉素的 12.5 mg/L 液體培養(yǎng)基，用封口膜密封，37 ℃恒溫箱箱中培養(yǎng)過夜。加入終濃度為10%的甘油，保存于-80 ℃。

1.3群體感應淬滅酶陽性克隆的篩選

本研究采用根癌農桿菌NTI（traR，tra：：lacZ749）對文庫進行篩選。將文庫單克隆接種于96孔培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)過夜。再加至終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，30 ℃進行誘導培養(yǎng)。取誘導培養(yǎng)5 h菌液與等體積2 μmol/L OOHL（3-oxo-C8-HSL）混合并反應2 h作為待測樣品（本研究以OOHL作為AHL分子標準品進行檢測）。以加有X-gal的MM瓊脂固體培養(yǎng)基為生測培養(yǎng)基，用無菌小刀將培養(yǎng)基瓊脂切成間隔的細條狀，在細條的上端加入待測的樣品，在樣品的下面連續(xù)點接農桿菌NTI，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察并記錄試驗結果。當樣品中存在AHL分子時，隨著分子在培養(yǎng)基內不斷向下擴散，激活生測菌株中l(wèi)acZ基因的表達，可使菌落呈現(xiàn)藍色； AHL分子濃度越大，擴散距離越遠，就有越多的指示菌變藍。通過觀察變藍的數(shù)量就可判斷AHL分子的濃度。本研究分別以OOHL分子與無菌水作為陽性對照與陰性對照，通過指示菌變色程度篩選陽性克隆。

2結果與分析

2.1鹽單胞菌基因組DNA的提取

本研究中鹽單胞菌1A01339基因組DNA提取采用改良的CTAB-NaCl法提取后進行瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1。高質量的基因組DNA為后續(xù)構建Fosmid文庫提供良好的樣品。

2.2Fosmid文庫構建質量鑒定與評價

由于構建Fosmid文庫需要將大片段的高質量基因組DNA剪切成大小均勻的片段（30～40 kb），而本試驗提取的鹽單胞菌基因組DNA片段完整，因此要對DNA進行剪切。電壓30～35 V電泳過夜，電泳檢測結果見圖2，可確定經250次剪切效果最佳。故以經250次剪切的基因組DNA為材料，采用低熔點瓊脂糖酶β-Agarase對DNA片段進行消化回收。經電泳檢測（圖3），發(fā)現(xiàn)回收片段介于23～42 kb之間，符合建庫要求，可以用于構建Fosmid文庫。

本試驗共獲得約1 700個克隆。隨機挑取14個克隆分析插入片段的大小。Not Ⅰ酶切片段進行低電壓普通瓊脂糖凝膠電泳。從圖4可以看到，14個陽性菌落的酶切產物中均有1條同樣大小的條帶，此條帶極為pCC1FOS載體（8.1 kb）。克隆子中插入最長片段約為42 kb，最短片段約為25 kb；將所有片段進行統(tǒng)計得到插入片段平均長度為35 kb，插入率為100%?？寺∑慰値烊葸_到60 Mb，假設該鹽單胞菌基因組以4.5 Mb為計，則整個文庫包含的DNA量超過該菌基因組的10倍，且克隆質粒酶切帶型多態(tài)性較強，說明了文庫克隆的隨機性大。

通過克隆的穩(wěn)定性檢測發(fā)現(xiàn)第100代酶切圖譜與第0代無任何明顯差異，未發(fā)現(xiàn)插入片段的丟失或重排，說明所構建的Fosmid文庫是穩(wěn)定的。高質量的Fosmid文庫提供了后續(xù)功能篩選陽性克隆的基礎。

2.3群體感應淬滅酶陽性克隆篩選

研究表明，對基因文庫進行活性篩選要比序列篩選容易獲得更新型的基因[7]。因此，從Fosmid文庫中挑取克隆子，利用功能驅動的藍白斑篩選AHL降解酶，并以此驗證活性篩選Fosmid文庫中生物催化劑的可行性。

常規(guī)研究多采用以β-葡萄糖苷酶為報告系統(tǒng)的基因重組菌株根癌農桿菌NTI（traR，tra：：lacZ749）篩選產AHL降解酶的菌株，其原理為：根癌農桿菌NTI中含有編碼受體蛋白TraR的traR基因和由tra啟動子控制表達的β-半乳糖甘酶基因tra：：lacZ749，同時自身缺失traI基因，不能合成AHL信號分子。當外源的AHL信號分子被加入時，traR基因表達的蛋白TraR 與AHL分子結合后可激活lacZ基因的表達，產生β-半乳糖甘酶從而使加有X-gal的平板培養(yǎng)基顯藍色。通過前期篩選工作，已確定該株鹽單胞菌1A01339具有群體感應淬滅活性（圖5）。

本研究對構建的Fosmid文庫進行高通量活性初篩，共獲得3個有活性的陽性克?。?0B4、11G10和23A3（圖6）。經后續(xù)驗證，這些Fosmid克隆均具有AHL降解酶活性，可為分離鑒定該菌株的群體感應淬滅酶開展后續(xù)研究。

3討論

基因組文庫是上世紀70年代末發(fā)展起來的一種研究基因組特性、分離新基因的技術手段，它包含了基因組的全套遺傳信息，人們可用相應的基因探針從文庫中調取出任一特定的基因片段加以研究。通過構建基因組文庫，再結合功能性篩選的方法，大量基因信息被發(fā)現(xiàn)。目前大部分研究傾向于

構建小片段質粒文庫，但與小片段文庫相比，大片段文庫如Fosmid文庫有明顯的優(yōu)點，因其插入片段長度較長（30～ 40 kb），單個克隆可涵蓋完整代謝途徑的多基因簇，可能更有利于基因及其周圍信息的發(fā)現(xiàn)，因而廣泛應用于對生物活性物質功能性篩選的研究中[9]，但用該方法篩選AHL降解酶基因的報道尚少見。因而，考慮到Fosmid文庫片段長度和容量上的優(yōu)勢，應用Fosmid文庫的方法可能利于群體感應淬滅酶的篩選和鑒定。

2000年，Dong等鑒定了2類分解AHL群體感應信號的水解酶——AHL內酯酶和酰胺酶，并發(fā)現(xiàn)將該類基因轉入植物病原菌胡蘿卜軟腐歐文氏菌后，減弱了各種試驗植物軟腐病的癥狀，從而首次提出群體淬滅生物防治的新概念[6]。這些研究的主要成果發(fā)表在《Nature》和《PNAS》等權威學術刊物上，開辟了群體淬滅這一新的研究領域[10-12]。自此以后，世界各國很多學者都開展了篩選分離AHL信號分子降解酶的工作，并發(fā)現(xiàn)了一系列AHL降解酶[13]。

本研究通過Fosmid文庫構建并成功篩選到具有群體感應淬滅活性的陽性克隆。利用改良的SDS-CTAB法提取1株鹽單胞菌基因組DNA，并采用Epicentre公司的文庫構建試劑盒成功構建了鹽單胞菌高質量的Fosmid基因組文庫，并通過功能驅動的藍白斑篩選群體感應淬滅酶，最后成功獲得3個Fosmid陽性克隆子。表明構建的Fosmid文庫能夠用于AHL降解酶的活性篩選，為后續(xù)開展分離鑒定該菌株的群體感應淬滅酶奠定了基礎。同時所構建的鹽單胞菌Fosmid文庫亦可進一步用于其他功能基因的開發(fā)。

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