朱曉峰，趙西擁，姜 濤，汪 清，王 嵩，倪皖莉

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，合肥230031）

花生抗病基因的研究進(jìn)展

朱曉峰，趙西擁，姜 濤，汪 清，王 嵩，倪皖莉

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，合肥230031）

花生病害嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，抗病品種的應(yīng)用是病害防治最有效的方法。為了準(zhǔn)確有效地鑒定和利用花生抗性資源，需要運(yùn)用基因技術(shù)手段來(lái)加快花生抗病品種的育成，本文介紹了花生葉斑病、黃曲霉病以及青枯病等主要病害的基因研究概況，其次歸納和總結(jié)了花生病害抗性相關(guān)分子標(biāo)記的研究進(jìn)展，并提出了今后基因技術(shù)和分子標(biāo)記輔助育種的研究方向，最后對(duì)多種抗病基因聚合育種進(jìn)行了展望。

花生；抗性基因；葉斑??；黃曲霉；青枯病

0 引言

花生是世界上重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物，既可當(dāng)油料和蛋白食用，又可以出口創(chuàng)匯。作為花生主要生產(chǎn)國(guó)之一，中國(guó)花生的總產(chǎn)量一直位居世界第一[1-2]。但隨著花生產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程加快，龐大的油籽加工行業(yè)對(duì)花生的需求量依舊非常大，因此，對(duì)花生品種的產(chǎn)量、抗病性等方面有了更高的要求[3]。病害不僅嚴(yán)重影響到花生的品質(zhì)，同時(shí)還是花生產(chǎn)量增加的一個(gè)重要限制因素。據(jù)調(diào)查顯示，中國(guó)每年由于病害原因?qū)е禄ㄉ漠a(chǎn)量下降高達(dá)30%，嚴(yán)重影響到中國(guó)花生的生產(chǎn)和出口[4]。

對(duì)于花生病害的防治主要還是利用化學(xué)和生物藥劑來(lái)抑制病原菌。但是化學(xué)藥劑的防治并不理想，存在著諸多的問(wèn)題。一方面，化學(xué)藥劑的使用會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染不利于環(huán)保，另一方面病原菌自身也會(huì)隨著藥劑的使用、花生品種的更替發(fā)生變異而產(chǎn)生抗藥性[4-5]。除此之外，防治一些病害的化學(xué)和生物藥劑還十分的昂貴，不僅要耗費(fèi)人力還要花費(fèi)財(cái)力，不適合大規(guī)模的推廣應(yīng)用。因而，抗病品種的應(yīng)用是病害防治的最有效方法[3-5]。

常規(guī)的育種方式不僅育種周期長(zhǎng)，選擇效率低，而且也很難將一些重要的抗性基因聚合到綜合性狀都很優(yōu)良的花生品種中。隨著科技的進(jìn)步和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以及抗病基因的分離與分子標(biāo)記的深入研究，花生抗病品種的選育已從傳統(tǒng)的方式慢慢向著更加深入的分子育種方向發(fā)展。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于花生病害分子研究方面已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，主要集中在花生葉斑病、青枯病以及黃曲霉病等病害抗性分子標(biāo)記方面，相關(guān)基因的克隆工作也取得了一定的進(jìn)展。然而，當(dāng)前的研究?jī)H是針對(duì)某一病害，不僅抗病效果單一，同時(shí)也不利于拓寬抗譜。因此，聚合不同類(lèi)型的多個(gè)抗病蟲(chóng)基因到同一材料中，提高材料的抗病等級(jí)、拓寬抗譜，是花生抗病品種培育的發(fā)展方向。本文擬就葉斑病、黃曲霉以及青枯病等主要病害相關(guān)抗性基因分離的研究情況做概括，同時(shí)對(duì)聚合多種抗病基因在花生育種生產(chǎn)上的應(yīng)用進(jìn)行展望，以便育種工作者能對(duì)抗病基因有個(gè)全面地了解，并根據(jù)實(shí)際情況有針對(duì)性地應(yīng)用到實(shí)際的花生抗病育種中，為花生抗病聚合育種提供參考依據(jù)。

1 葉斑病抗性基因

花生葉斑病包括褐斑病和黑斑病，主要危害花生葉片，嚴(yán)重時(shí)葉柄、托葉、莖干和果針（莢果）均可受害[6]。前人研究表明葉斑病抗性是由2對(duì)以上的核隱性基因控制的，而且褐斑病和黑斑病抗性遺傳是分別獨(dú)立的[7-9]。Nevill[10]在前人研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究得出，花生晚斑病抗性是由5個(gè)隱性基因控制。此外，通過(guò)對(duì)花生突變體的研究，Soriano等[11]發(fā)現(xiàn)對(duì)葉斑病產(chǎn)生抗性的2個(gè)突變基因IS-1和IS-2，2個(gè)突變基因編碼的蛋白主要是通過(guò)抑制病原菌的生長(zhǎng)從而對(duì)病原菌產(chǎn)生抗性抑制。

目前，有關(guān)于花生葉斑病抗性分子研究的報(bào)道不是很多，主要是晚斑病的分子研究。夏友霖等[12]以抗感晚斑病花生品種‘中花5號(hào)’與‘ICGV86699’雜交后的F2代分離群體為材料，通過(guò)AFLP結(jié)合BSA法，從中篩選到了與晚斑病抗性緊密連鎖的3個(gè)AFLP標(biāo)記E35/M51、E37/M48和E41/M47。利用SSR標(biāo)記和抗病類(lèi)似片段開(kāi)發(fā)的豆類(lèi)錨定標(biāo)記(legume anchor marker)，篩選了93份以二倍體野生品種‘K7988’בV10309’為組合的F2代分離群體構(gòu)建遺傳圖譜，Leal-Bertioli等鑒定出了5個(gè)晚斑病抗性QTL位點(diǎn)和34個(gè)序列特定的候選基因片段[13]。Khedikar等[14]以268份‘TAG24’בGPBD4’構(gòu)建的重組自交系(Recombinant inbred line,RIL)群體為材料，構(gòu)建了14個(gè)遺傳連鎖群，在3個(gè)環(huán)境下共鑒定了11個(gè)晚斑病抗性QTL位點(diǎn)，可解釋晚斑病表型變異的1.70%～6.5%。Sujay等[15]進(jìn)一步在‘TAG24’בGPBD’和‘TG 26’בGPBD4’構(gòu)建的RIL群體中，分別鑒定了13個(gè)和15個(gè)與晚斑病抗性緊密連鎖的QTL位點(diǎn)。此外，Guimar?es等[16]分析侵染晚斑病后的野生種的轉(zhuǎn)錄組成分，獲得多個(gè)與晚斑病抗性相關(guān)的表達(dá)差異基因，同時(shí)開(kāi)發(fā)了多個(gè)特異性抗性分子標(biāo)記。

葉斑病抗性相關(guān)基因的分離近年也有報(bào)道，Luo等[17]分析不同抗性品種在接種后384個(gè)的轉(zhuǎn)錄本變化情況，尋找抗性基因片段。Kuamar等[18]從接種48 h后的野生種A.diogoi中分離了2個(gè)上調(diào)基因的部分cDNA序列，進(jìn)一步通過(guò)RACE方法獲得其中一個(gè)編碼類(lèi)環(huán)素類(lèi)似蛋白基因AdCyp的全長(zhǎng)。此外，AhGLP抗病基因家族成員AhGLP3b、AhGLP5b和AhGLP7b也首次被報(bào)道[19]。病原菌相關(guān)蛋白PR-5和防衛(wèi)素是植物一類(lèi)抗真菌蛋白，通過(guò)構(gòu)建Sniolp和RsAFP2雙基因載體轉(zhuǎn)入花生，轉(zhuǎn)基因花生明顯提高了對(duì)黑斑病的抗性[20]。另外，轉(zhuǎn)基因研究方面，水稻和煙草的幾丁質(zhì)酶基因以芥菜生物防御素基因轉(zhuǎn)化到花生后均能提高對(duì)葉斑病的抗性[21-23]。

2 黃曲霉抗性基因

花生是一種地上開(kāi)花，地下結(jié)莢果的作物，莢果長(zhǎng)時(shí)間與地面土壤接觸，因而很容易受到黃曲霉的侵染?；ㄉ鷮?duì)黃曲霉抗性是由主基因和微效基因共同控制的，主要分為侵染抗性和產(chǎn)毒抗性2種[24]。目前，花生黃曲霉抗性分子的研究是國(guó)內(nèi)花生抗病分子研究中最為廣泛的。利用‘J11’（抗病品種）和‘中花5號(hào)’（感病品種）雜交F2代分離的極端材料，獲得了2個(gè)與黃曲霉侵染抗性基因緊密連鎖的AFLP標(biāo)記E44M53-520和E45M53-440，同時(shí)對(duì)這2個(gè)標(biāo)記進(jìn)行了驗(yàn)證。通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)一步將其中一個(gè)標(biāo)記E45M53-440轉(zhuǎn)換成操作更簡(jiǎn)單的、結(jié)果更穩(wěn)定的的SCAR標(biāo)記“AFs-412”[25-26]。通過(guò)篩選12個(gè)黃曲霉侵染抗感花生品種基因組DNA，5對(duì)與黃曲霉侵染抗性關(guān)聯(lián)的標(biāo)記被鑒定，其中pPGSseq19D9能夠直接區(qū)分抗感品種，與抗性基因位點(diǎn)緊密連鎖[27]。利用抗感品種‘ICG12625’ב中花10號(hào)’構(gòu)建的RIL群體，李前波等[28]鑒定出6個(gè)與黃曲霉侵染抗性緊密連鎖的QTL位點(diǎn)和10個(gè)與黃曲霉產(chǎn)毒相關(guān)的QTL位點(diǎn)。

花生黃曲霉抗性基因分離的方法目前主要是利用同源克隆方法、基因芯片技術(shù)分析差異表達(dá)基因結(jié)合RACE的方法以及利用抗性相關(guān)的EST序列結(jié)合RACE的方法。謝純政等[29]從抗黃曲霉品種‘粵油20’中分離黃曲霉抗性基因ARAhPR10，該基因是PR10家族的一個(gè)新成員。通過(guò)基因芯片技術(shù)結(jié)合熒光定量PCR，從花生抗感品種中分離出6條黃曲霉侵染后表達(dá)差異顯著的基因片段，進(jìn)一步RACE獲得與黃曲霉侵染抗性相關(guān)的AW68基因[30]。嚴(yán)海燕等[31]根據(jù)黃曲霉抗性相關(guān)的EST序列，從黃曲霉抗性品種‘J11’中克隆了一個(gè)與核糖體蛋白L41相似的基因，該基因在抗性品種發(fā)育種子中的表達(dá)量顯著高于敏感品種。姜煥煥等[32]分析干旱脅迫和黃曲霉侵染下不同抗性品種的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)iso-ARAhPR3顯著上調(diào)。脂肪氧化酶基因LOX-1的活性可以作為鑒定花生品種黃曲霉抗性的一個(gè)指標(biāo)，張廷婷等[33]、周延清等[34]從花生品種‘J11’中分離出與黃曲霉抗性相關(guān)的脂肪氧化酶基因PnLOX2。

NBS基因家族是植物中最大的一個(gè)抗病基因家族，Yuksel等[35]利用已有植物抗病基因的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物和特異引物，從花生中獲得了234個(gè)抗病基因類(lèi)似物。晏立英等[36]利用同樣方法從花生6號(hào)品種幼葉中獲得了5條具有完整ORF框的抗病基因序列。同樣地，根據(jù)NBS保守結(jié)構(gòu)域同源克隆以及RACE技術(shù)相結(jié)合的手段，劉宇等[37]從花生黃曲霉高抗的品種‘J11’中克隆了NBS類(lèi)抗病基因PnAG3基因的全長(zhǎng)，并且通過(guò)該基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，該基因可能與黃曲霉抗性密切相關(guān)。在前人的研究基礎(chǔ)上，王春緯等[38]進(jìn)一步克隆了2個(gè)花生黃曲霉抗性基因PnAG-1和PnAG-2，這2個(gè)基因均具有NBS-LRR家族典型的保守結(jié)構(gòu)域。

3 青枯病抗性基因

花生青枯病是一種土傳性的毀滅性病害，迄今沒(méi)有什么有效的防治方法，主要是抗病品種的培育和作物輪作[39]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于花生青枯病抗性遺傳的研究，普遍認(rèn)為其抗性遺傳主要受主基因控制，但也存在微效基因修飾。廖伯壽等[40]研究結(jié)果表明，花生青枯病抗性遺傳是由細(xì)胞核控制的，而且是受主基因控制的，抗性容易轉(zhuǎn)移。

花生青枯病抗性分子研究方面主要是分子標(biāo)記和QTL抗性位點(diǎn)。姜慧芳等[41]以抗青枯病花生品種‘遠(yuǎn)雜9102’與感病品種‘Chico’雜交后代構(gòu)建的RIL群體為材料，獲得2個(gè)與抗青枯病緊密連鎖的SSR標(biāo)記7G02和PM137，與抗病基因之間的遺傳距離分別為10.9 cM和13.8 cM。彭文舫等[42]利用這個(gè)RIL群體構(gòu)建的AFLP遺傳圖譜，鑒定到了3個(gè)與青枯病抗性相關(guān)的QTL（qWBr1、qWBr2和qWBr3），其中，qWBr1和 qWBr2與qWBr3分別形成2個(gè)加性互作效應(yīng)的片段，可分別解釋青枯病抗性效應(yīng)的12.81%和16.56%。任小平等[43]利用24份不同青枯病抗性種質(zhì)構(gòu)建AFLP指紋圖譜，而且其中的6對(duì)AFLP標(biāo)記就可有效區(qū)分這些花生種質(zhì)。他還通過(guò)BSA法分析‘中花5號(hào)’ב遠(yuǎn)雜9102’構(gòu)建的RIL群體，獲得2個(gè)與花生青枯病抗性基因有關(guān)的標(biāo)記P1M58和P3M59，與抗性基因之間的遺傳距離分別為13.93 cM和8.73 cM。此外，徐志軍等[44]利用SSR引物分析花生不同品種間的多樣性，發(fā)現(xiàn)10個(gè)與青枯病抗性顯著相關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn)。

雖然有關(guān)植物青枯病抗性基因的報(bào)道不少，但主要是擬南芥和番茄，花生抗青枯病基因的報(bào)道基本沒(méi)有。目前，花生青枯病抗性基因的研究主要是青枯病誘導(dǎo)后的花生SSH文庫(kù)構(gòu)建和分析，以及青枯病菌侵染后的表達(dá)差異基因分析[45-46]。以花生抗青枯病品種‘閩花8號(hào)’為材料，通過(guò)SMART技術(shù)構(gòu)建青枯病菌誘導(dǎo)后花生根部的cDNA文庫(kù)，同時(shí)構(gòu)建了攜帶擬南芥抗青枯病基因RRS1的表達(dá)載體，為青枯病抗性基因的分離和研究奠定了基礎(chǔ)[47]。利用cDNA-AFLP技術(shù)分析青枯病菌侵染后的抗感青枯病花生品種‘遠(yuǎn)雜9102’和‘中花12’中的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)256對(duì)引物篩選出的119對(duì)引物中，出現(xiàn)了709條表達(dá)差異的轉(zhuǎn)錄衍生片段(Transcript-derived fragment，TDF)，其中TDF32-54-1與青枯病抗性有關(guān)[48]。

4 其他抗病基因

花生抗病分子標(biāo)記方面，最先是在抗線蟲(chóng)病中研究的。Halward等[49]利用RFLP標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜，鑒定了一個(gè)與抗線蟲(chóng)病緊密連鎖的標(biāo)記R239。王輝等[50]獲得2個(gè)與抗線蟲(chóng)病緊密連鎖的SSR標(biāo)記S32-380和S89-140，這2個(gè)標(biāo)記分別位于抗線蟲(chóng)病基因的兩側(cè)，與抗病基因之間的遺傳距離分別為4.412cM和7.404cM?；ㄉ】剐苑矫妫琀erselma等[51]和肖洋等[52]分別定位了一個(gè)抗病隱性單基因和與抗性基因緊密連鎖的一個(gè)分子標(biāo)記，可解釋76.1%的效應(yīng)?；ㄉP病抗性方面，Khedikar等[14]檢測(cè)到了12個(gè)與銹病抗性有關(guān)的QTL位點(diǎn)，可解釋1.70%～55.20%。侯慧敏等[53]獲得與抗性顯著相關(guān)的2個(gè)標(biāo)記M3L3和M8L8。此外，張新友等[54]鑒定到一個(gè)與網(wǎng)斑病有關(guān)的QTL位點(diǎn)qWB-1-7，可解釋表型效應(yīng)5.76%。

5 展望

病蟲(chóng)害一直是影響花生產(chǎn)量和品質(zhì)的一個(gè)重要因素，眾多研究結(jié)果已經(jīng)證明花生病蟲(chóng)害防治的有效手段就是抗病新品種的應(yīng)用。隨著現(xiàn)代分子技術(shù)的快速發(fā)展，傳統(tǒng)的常規(guī)育種方式已經(jīng)不能滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)花生抗病新品種的需求。分子標(biāo)記技術(shù)是在DNA水平上選擇優(yōu)良親本，利用與抗病等重要性狀緊密連鎖的標(biāo)記對(duì)雜種后代進(jìn)行快速有效的選擇，可在早期通過(guò)標(biāo)記篩選是否攜帶抗性基因，從而縮短育種年限、加快育種進(jìn)程。因而，通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)將多個(gè)抗性基因聚合到同一個(gè)材料中成為花生育種的一個(gè)主要方向。目前，盡管花生抗性分子標(biāo)記的研究有了一定的進(jìn)展，但是抗性材料遺傳基礎(chǔ)狹窄，抗性基因尤其主基因的資源有限，真正起到高抗性或者廣普抗性的基因很少。因而，充分挖掘和利用抗病基因還有待進(jìn)一步的研究。另外，一些抗性較好的資源可能會(huì)有很多不利的基因，這些基因和目標(biāo)基因緊密連鎖，常規(guī)的方式很難打破，連續(xù)回交又可能會(huì)丟失目標(biāo)基因。因此，在今后的花生育種中應(yīng)加強(qiáng)以下幾點(diǎn)研究：（1）應(yīng)用分子標(biāo)記進(jìn)行抗病性狀的輔助育種，同時(shí)結(jié)合常規(guī)育種，充分挖掘花生種質(zhì)的遺傳多樣性；（2）利用花生不同抗病種質(zhì)構(gòu)建的群體構(gòu)建遺傳圖譜，對(duì)抗病基因進(jìn)行定位，挖掘抗病基因；（3）利用分子標(biāo)記技術(shù)和基因工程技術(shù)，將多個(gè)優(yōu)質(zhì)抗性基因聚合到同一個(gè)花生新品種。

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Research Progress of Disease Resistance Genes in Peanut

Zhu Xiaofeng,Zhao Xiyong,Jiang Tao,Wang Qing,Wang Song,Ni Wanli
(Institute of Crops,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Hefei 230031,Anhui,China)

Disease is a serious threat for the production and quality of peanut.Planting disease resistant cultivars is the most feasible method for preventing and controlling peanut diseases.In order to identify and utilize peanut germplasms with resistance efficiently and accurately,we need to use genetic technology to speed up the breeding process of peanut resistant varieties.First,we introduced the research status of disease resistance genes in peanut,including leaf spot,Aspergillus flavus,and bacterial wilt and so on.Secondly,we concluded and summarized the research status of molecular markers related with peanut disease resistance, and pointed out the research direction of gene technology and molecular marker-assisted breeding in the future.Finally,we discussed the multiple-genes pyramiding breeding for disease resistance.

Peanut;Resistance Genes;Leaf Spot;Aspergillus flavus;Bacterial Wilt

S565.2

A論文編號(hào)：cjas16110001

國(guó)家花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系合肥綜合試驗(yàn)站（CARS-14-合肥綜合試驗(yàn)站）；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)科建設(shè)面上項(xiàng)目“花生高產(chǎn)抗病種質(zhì)鑒定及創(chuàng)制”(14A0215)；安徽省農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目“高產(chǎn)油用花生新品種皖花9號(hào)中試與示范”(1504032003)。

朱曉峰，女，1989年出生，安徽無(wú)為人，助理研究員，博士，研究方向?yàn)榛ㄉ共∵z傳育種。通信地址：230031安徽省合肥市廬陽(yáng)區(qū)農(nóng)科南路40號(hào)安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所花生室，Tel：0551-65168162，E-mail：zhuxf19900126@163.com。

倪皖莉，女，1968年出生，安徽祁門(mén)人，副研究員，碩士，主要從事花生種質(zhì)資源鑒定和創(chuàng)新研究。通信地址：230031安徽省合肥市廬陽(yáng)區(qū)農(nóng)科南路40號(hào)安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所花生室，Tel：0551-65160614，E-mail：wlpeanut@163.com。

2016-11-01，

2016-12-13。