陳雅 綜述，朱進(jìn)，馮振卿 審校

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新型人感染H7N9型禽流感病毒研究進(jìn)展

陳雅 綜述，朱進(jìn)，馮振卿 審校

2013年3月31日，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心（CDC）正式公布3例人感染H7N9型禽流感確診病例。經(jīng)檢測(cè)，這是一種新型禽流感病毒，本次是該類型病毒第一次被證實(shí)感染人類。首發(fā)的3例患者分別來(lái)自上海及安徽，此后該病迅速在中國(guó)大陸及港澳臺(tái)地區(qū)蔓延，并呈現(xiàn)季節(jié)性流行趨勢(shì)。該病發(fā)病迅猛，死亡率高。2013年11月，CDC正式將其納入乙類傳染病范疇并按照甲類傳染病標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行管理，按月通報(bào)流行狀況。疾病發(fā)生后研究人員迅速對(duì)病毒來(lái)源、病毒特性、感染特征、檢測(cè)措施及防治手段等方面展開(kāi)調(diào)查研究。

1 新型人感染H7N9型禽流感病毒的流行病學(xué)特征

1.1 流行概況

2013年2月，新型H7N9型禽流感病毒感染病例起于華東地區(qū)，后蔓延全國(guó)。2014年及2015年均有兩次流行高峰，發(fā)病高峰期為冬春季節(jié)，這與較低的氣溫更適宜病毒生存有關(guān)?；颊吣挲g跨度廣，性別及年齡分布有其獨(dú)特性。

1.2 傳染源與宿主

將患者咽拭子標(biāo)本與呼吸道分泌物標(biāo)本中分離得到的病毒基因與環(huán)境或家禽中得到的H7N9 型禽流感病毒基因進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，證實(shí)兩者具有高度同源性。中國(guó)通過(guò)關(guān)閉禽類交易市場(chǎng)及撲殺可能感染的禽類，極大地降低了疾病的蔓延和發(fā)病率，這也從流行病學(xué)角度間接證明禽類為人類感染H7N9 型禽流感的主要傳染源。此外，也有報(bào)道1例江蘇病例，女兒密切接觸父親后6 d發(fā)病，并最終相繼死亡。經(jīng)基因檢測(cè)，兩人感染病毒高度一致，提示該病例有可能是由于密切接觸患者的分泌物導(dǎo)致的人傳人病例。

1.3 傳播途徑

流行病學(xué)證實(shí)，患者多有禽類直接或間接接觸史，絕大多數(shù)病例均曾接觸禽類。中國(guó)大陸地區(qū)尤其是農(nóng)村地區(qū)多有活禽交易市場(chǎng)，粗放式的管理方式加劇了禽流感病毒的傳播，進(jìn)入市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)家禽或從事相關(guān)工作均有可能感染。禽流感病毒也可通過(guò)環(huán)境傳播，接觸病毒污染的水源等可能致病。此外，目前報(bào)道的少數(shù)家族聚集性病例表明，病毒可能通過(guò)密切接觸發(fā)生有限人傳人，但尚未發(fā)現(xiàn)3人以上可能的聚集性病例。目前的檢測(cè)結(jié)果提示，H7N9型禽流感病毒傳播能力介于H5N1型高致病性禽流感和季節(jié)性流感病毒A（H3N2）之間。Zhang等利用從人體分離得到的H7N9禽流感病毒感染雪貂，可致該病在雪貂間通過(guò)飛沫傳播，這表明病毒具備在哺乳動(dòng)物之間發(fā)生飛沫傳播的能力。

1.4 易感人群

病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)疾病嚴(yán)重程度與年齡、基礎(chǔ)疾病、免疫狀況密切相關(guān)。患者多為老年人，且多有慢性支氣管炎、高血壓、糖尿病以及心肺疾病等基礎(chǔ)疾病，有長(zhǎng)期服用藥物史。此外，患者約70%為男性，且大多居住于農(nóng)村，這與農(nóng)村中老年男性因工作或生活原因有更多機(jī)會(huì)接觸禽蛋類商品及飼養(yǎng)禽類環(huán)境密切相關(guān)。

2 新型人感染H7N9型禽流感病毒的病原學(xué)特征

2.1 H7N9型禽流感病毒基因來(lái)源、重組與跨物種傳播機(jī)制

CDC對(duì)最早確診的3例患者體內(nèi)分離的流感病毒株進(jìn)行基因分析后發(fā)現(xiàn)，編碼病毒血凝素（hemagglutinin，HA）的基因與鴨群中分離得到的H7N3型禽流感病毒株A/duck/Zhejiang/12/2011（H7N3）高度同源，編碼病毒神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）的基因與韓國(guó)遷徙野鳥(niǎo)中發(fā)現(xiàn)的H7N9型禽流感病毒株A/wild bird /Korea /A14/2011（H7N9）高度同源，其余6個(gè)內(nèi)部基因片段（PB2、PB1、PA、NP、M 及NS）與2012 年中國(guó)禽鳥(niǎo)中分離得到的A/brambling /Beijing /16 /2012 （H9N2）高度同源。該結(jié)果提示此次流行的H7N9 型禽流感病毒為重配新型病毒。隨著更多病例的出現(xiàn)及深入研究，Wu等發(fā)現(xiàn)該病毒是由兩次重配產(chǎn)生。第1次發(fā)生在歐亞起源的野鳥(niǎo)和中國(guó)野鳥(niǎo)之間，前者提供HA及NA基因，后者提供內(nèi)部的6個(gè)基因，由此形成原始的H7N9型禽流感病毒。此后該病毒感染家鳥(niǎo)并與家禽中的H9N2型禽流感病毒于2012年初發(fā)生第2次重組，基因突變和后續(xù)的小型重組事件導(dǎo)致病毒的多樣性，此外，發(fā)現(xiàn)基因突變導(dǎo)致該病毒在禽類中的適應(yīng)性增強(qiáng)。由于新型H7N9禽流感病毒HA 酶切位點(diǎn)為EIPKGR* GL（*為酶切位點(diǎn)），提示其在禽類中的低致病性，因此新型H7N9病毒得以在禽類宿主中蔓延并獲得適應(yīng)及感染人類的機(jī)會(huì)。

2.2 H7N9型禽流感病毒關(guān)鍵位點(diǎn)突變

禽流感治療中的一線藥物包括M2 離子通道阻滯劑及神經(jīng)氨酸酶抑制劑兩大類?，F(xiàn)已證實(shí)H7N9型禽流感病毒已發(fā)生S31N突變，這導(dǎo)致該病毒對(duì)M2離子通道阻滯劑耐藥。約10%的H7N9型禽流感病毒對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑耐藥，這些病毒均發(fā)生R292K突變。人類呼吸道上皮存在兩種唾液酸受體，包括含有α-2,3-半乳糖苷鍵的受體及含有α-2,6-半乳糖苷鍵的受體，α-2,3型受體常見(jiàn)于禽類呼吸道表面，更易結(jié)合禽流感病毒，而人類呼吸道表面更多見(jiàn)的是α-2,6型受體。HA上同時(shí)發(fā)生Q226L及G186V突變，較只有一個(gè)突變的病毒對(duì)α-2,6型受體結(jié)合的能力顯著增加。此外，HA受體結(jié)合區(qū)150環(huán)發(fā)生T160A突變減弱了病毒與α-2,3型受體的結(jié)合能力，同樣導(dǎo)致病毒結(jié)合人類受體的能力增加。病毒PB2蛋白上同時(shí)發(fā)生E627K及D701N突變導(dǎo)致聚合酶活性增強(qiáng)并使病毒在哺乳細(xì)胞中的復(fù)制能力顯著上升，對(duì)小鼠的毒性顯著增強(qiáng)以及在雪貂間的傳播增加。

3 新型人感染H7N9 型禽流感病毒的特征

人感染H7N9型禽流感潛伏期一般≤7 d，輕癥或早期患者表現(xiàn)為流感樣癥狀，如發(fā)熱、頭痛，咳嗽、咳痰、咳血、肌肉酸痛等。后可迅速進(jìn)展，表現(xiàn)為高熱、重癥肺炎、呼吸困難，部分患者可出現(xiàn)橫紋肌溶解癥、急性腎損傷、肝功能障礙以及腦病，嚴(yán)重者可表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征、彌散性血管內(nèi)凝血、休克、多器官功能衰竭綜合征（multiple organ failuresyndrome，MOFS），甚至死亡。

胸部X線片及CT檢查中，患者肺部改變最為突出，表現(xiàn)為單側(cè)或雙側(cè)肺毛玻璃樣改變、肺紋理增強(qiáng)以及多灶性肺實(shí)變，其中肺實(shí)變表現(xiàn)最為常見(jiàn)。此外還有胸膜腔積液、縱隔氣腫以及繼發(fā)的皮下氣腫和氣胸等影像學(xué)表現(xiàn)。

急性期患者血樣實(shí)驗(yàn)室檢查發(fā)現(xiàn)，血清中的趨化因子及細(xì)胞因子IP-10、MIG、MIP-1β、MCP-1、IL-6、IL-8 and IFN-α等顯著增高，表明患者重癥感染極有可能是由“細(xì)胞因子風(fēng)暴”引起。患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)正常或降低，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)正?；蛏摺４送?，住院患者可發(fā)生肺炎克雷伯菌感染、肺炎鏈球菌感染以及耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染等，在死亡患者中尤為顯著，因此感染特別是耐藥菌的感染可能是致死原因之一。

病理解剖發(fā)現(xiàn)，患者肺內(nèi)常表現(xiàn)為急性彌漫性肺泡損傷、肺泡間隔出血、彌漫性肺泡損傷后纖維化增生以及肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞胞漿及胞核核蛋白沉積，雪貂實(shí)驗(yàn)的肺部病理切片也出現(xiàn)相似表現(xiàn)。除典型的呼吸道病變，全身各器官均可受累，表現(xiàn)為脾淋巴組織萎縮，骨髓嗜血細(xì)胞現(xiàn)象，腎小管變性、壞死以及肝細(xì)胞空泡變性等，進(jìn)一步證實(shí)發(fā)生MOFS。

4 新型人感染H7N9型禽流感病毒的檢測(cè)手段

禽流感病毒的檢測(cè)包括病毒的分離與培養(yǎng)以及血清學(xué)診斷等傳統(tǒng)的檢測(cè)方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測(cè)。

4.1 病毒的分離與培養(yǎng)

收集患者痰標(biāo)本、咽拭子標(biāo)本等呼吸道分泌物標(biāo)本并盡快送檢，主要利用雞胚或細(xì)胞進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)。該檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果對(duì)明確禽流感診斷具有重要意義，但其周期長(zhǎng)且操作復(fù)雜，不易在基層一線推廣。

4.2 病毒的血清學(xué)檢測(cè)

血清學(xué)檢測(cè)主要基于特異性的抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行。瓊脂糖擴(kuò)散（AGP）試驗(yàn)可用于鑒定A型禽流感病毒。血凝試驗(yàn)（HA）及血凝抑制試驗(yàn)（HI）可鑒別禽流感病毒表面的HA亞型，神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)（NI）可鑒別禽流感病毒表面的NA亞型。病毒中和試驗(yàn)具有良好的敏感性及特異性，在病毒鑒定及對(duì)照試驗(yàn)中起著重要作用。此外，ELISA 檢測(cè)、免疫組織化學(xué)、免疫熒光技術(shù)等也是禽流感病毒檢測(cè)的常用技術(shù)手段。

4.3 病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)大大拓展了禽流感的檢測(cè)手段。PCR技術(shù)直接實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的檢測(cè)，包括RT-PCR技術(shù)、熒光定量實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)、多重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)等在內(nèi)的多種衍生技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用?；蛐酒ㄟ^(guò)將探針結(jié)合于固相載體表面，通過(guò)檢測(cè)熒光標(biāo)記的樣品與探針的結(jié)合以同時(shí)檢測(cè)樣品中的大量核酸序列。最近興起的高通量測(cè)序技術(shù)可短時(shí)間內(nèi)對(duì)樣品內(nèi)十萬(wàn)至數(shù)百萬(wàn)未知基因分子進(jìn)行精確測(cè)定。

5 新型人感染H7N9型禽流感病毒的防治策略

5.1 治療藥物

在禽流感一線藥物中，新型人感染H7N9型禽流感病毒已對(duì)M2離子通道阻滯劑耐藥，雖然目前神經(jīng)氨酸酶抑制劑仍是H7N9型禽流感一線藥物，但部分病毒已發(fā)生R292K耐藥性突變，新型抗禽流感藥物的研制迫在眉睫。

一種已被批準(zhǔn)使用的天然干擾素Alferon N（IFN-α-n3）被發(fā)現(xiàn)具有抑制對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑耐藥的H7N9型禽流感病毒復(fù)制的功能。唾液酸酶融合蛋白DAS181（fludase）通過(guò)使宿主呼吸道上皮表面唾液酸受體失活，使得病毒HA 無(wú)法與受體結(jié)合，從而干擾病毒侵襲宿主的關(guān)鍵步驟。

Zhang等利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)研制出的單鏈抗體4F5以及利用雜交瘤技術(shù)研制出的IgG抗體8G10D7對(duì)多株H5N1型禽流感病毒有廣譜中和作用，其結(jié)合血凝素HA1亞基保守抗原表位WLLGNP。最近Chen等也利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)研制出Fab抗體HNIgGA6和HNIgGB5，通過(guò)結(jié)合H7N9型禽流感病毒HA 的抗原結(jié)合位點(diǎn)186V和226L發(fā)揮中和作用。

已在臨床上被批準(zhǔn)用于惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移性骨痛或癌性高鈣血癥的藥物氨羥二磷酸二鈉（pamidronate）可通過(guò)刺激Vδ2-T細(xì)胞發(fā)揮抗H7N9病毒的作用，抑制小鼠體內(nèi)病毒復(fù)制與炎癥反應(yīng)，提高生存率。此外，中國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥在禽流感治療中的地位不容忽視。已有報(bào)道顯示疏風(fēng)清熱膠囊、蓮花清瘟膠囊、麻杏石甘湯、銀翹沖劑、金花清感顆粒等多種中藥對(duì)禽流感有效。

5.2 預(yù)防策略

作為新型禽流感病毒，H7N9 病毒缺乏特異性疫苗。世界衛(wèi)生組織推薦A/Shanghai/2/2013（H7N9）和A/Anhui/1/2013（H7N9）作為H7N9禽流感病毒的疫苗候選株，用以研發(fā)特異性疫苗。目前正在研發(fā)的H7N9型禽流感疫苗包括如下幾類：

5.2.1 全病毒滅活疫苗及裂解疫苗

2015年1月由Jackson等完成的A/Shanghai/2/13（H7N9）全病毒滅活疫苗的Ⅱ期臨床試驗(yàn)表明，輔以AS03或MF59佐劑的疫苗在兩劑注射后受試者血清抗體陰性轉(zhuǎn)陽(yáng)性率分別為84%和57%。此外，中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局于2015年1月向華蘭生物工程股份有限公司下發(fā)H7N9流感全病毒滅活疫苗及裂解疫苗藥物臨床試驗(yàn)批件，有望研制出國(guó)產(chǎn)特異性疫苗。

5.2.2 減毒活疫苗

在目前研發(fā)的減毒活疫苗中，Rudenko等利用A/17/Anhui/2013/61（H7N9）重組疫苗株研制的H7N9減毒活疫苗已于2014年成功進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)，兩次免疫后誘發(fā)細(xì)胞免疫及體液免疫的比例達(dá)93%。

5.2.3 亞單位疫苗

Song等利用overlap-PCR技術(shù)將HA頭部片段（HA1-2，aa 62-284）與TLR5配體fliC進(jìn)行重組所表達(dá)HA1-2-fliC亞單位疫苗可在小鼠體內(nèi)形成高IgG滴度并可至少維持3個(gè)月。To等制備的A（H7N9）-HA2與咪喹莫特佐劑共同注射，兩劑后可對(duì)小鼠形成100%的保護(hù)，其認(rèn)為該疫苗可能是通過(guò)Fc段介導(dǎo)ADCC效應(yīng)發(fā)揮作用。而He等則發(fā)現(xiàn)血凝素莖部HA2的存在會(huì)減弱攜帶Fc段的HA亞單位疫苗的免疫原性，因此認(rèn)為應(yīng)避免其出現(xiàn)。

5.2.4 重組活載體疫苗

Kreijtz等以減毒Ankara病毒為載體，制備的MVAH7-Sh2疫苗可減少雪貂體內(nèi)病毒復(fù)制，并減輕多種癥狀。Liu等利用反義基因工程技術(shù)將Anhui/1/2013H7N9禽流感病毒HA基因插入NDV疫苗株P(guān)和M基因之間，研制出的以新城疫病毒為載體的NDV-H7疫苗可誘發(fā)較高的血凝抑制抗體滴度。Cao等研發(fā)的鼻病毒載體疫苗HAd-H7HA在小鼠模型中可誘發(fā)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

5.2.5 DNA疫苗

Yan等成功利用DNA疫苗合成平臺(tái)合成H7N9型禽流感DNA疫苗pH7HA，該疫苗對(duì)多株H7N9病毒血凝素均有較高的抗體滴度，在接受免疫小鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)大量效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生，對(duì)A/Anhui/1/2013（H7N9）病毒感染的小鼠保護(hù)率達(dá)100%。

6 結(jié)語(yǔ)

H7N9型禽流感目前仍為散發(fā)，但其大流行風(fēng)險(xiǎn)及高致病性應(yīng)引起高度重視。需加強(qiáng)對(duì)其基因的監(jiān)測(cè)以防范大范圍人傳人事件的發(fā)生。由于目前可有效抵抗該病毒的藥物有限，且病毒突變速度快，因此需進(jìn)一步深入研究該病毒特性并研發(fā)相應(yīng)治療藥物。此外，針對(duì)H7N9型禽流感病毒的預(yù)防措施并不完善，應(yīng)加快特異性疫苗的研發(fā)。?

【作者單位：1. 南京醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系；2. 南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所】

（摘自《醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)》2016年7期）