人EGFR突變基因檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)問題解析

【作 者】吳傳松1，黃杰2，安娟娟1，鄧剛1

1 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心，北京市，100044 2 中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京市，100050

腫瘤個(gè)體化治療相關(guān)突變基因檢測(cè)試劑快速發(fā)展，其中，人表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）突變基因檢測(cè)作為腫瘤個(gè)體化治療的分子靶標(biāo)受到普遍關(guān)注。該文將通過對(duì)過往人EGFR突變基因檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)過程中存在的常見問題進(jìn)行解析，闡述該類問題的解決辦法，希望對(duì)從事該類產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)的行業(yè)人員提供參考和幫助。

人表皮生長(zhǎng)因子受體；突變基因

0 引言

人EGFR突變基因檢測(cè)試劑主要是指基于位點(diǎn)特異熒光-核酸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ARMS-PCR法）、基因測(cè)序方法等技術(shù)，以EGFR突變基因序列為檢測(cè)目標(biāo)，體外檢測(cè)人體病理組織和/或外周血等樣本。研究表明EGFR突變基因在多種腫瘤細(xì)胞中存在，這些突變基因是腫瘤患者是否對(duì)TKI敏感的預(yù)測(cè)因子且被認(rèn)為是TKI治療的有效預(yù)測(cè)指標(biāo)[1]。EGFR突變基因主要發(fā)生在胞內(nèi)酪氨酸激酶（TK）區(qū)域的前四個(gè)外顯子上（18～21）[2]。隨著一代EGFR-TKIs治療藥物的使用，也發(fā)現(xiàn)了一些可能的耐藥突變，如發(fā)生在外顯子20上的替代突變T790M[3-4]。針對(duì)這些耐藥突變，目前也開發(fā)了一些新型藥物，如針對(duì)T790M耐藥的新藥物等[5]。此外，還有許多類型的突變臨床意義尚不明確。

1 人EGFR突變基因檢測(cè)試劑注冊(cè)審評(píng)現(xiàn)狀

在我國(guó)，依據(jù)《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》[6]關(guān)于產(chǎn)品分類的要求，該類產(chǎn)品按照第三類產(chǎn)品進(jìn)行管理。在美國(guó)FDA，人EGFR突變基因檢測(cè)試劑被歸為體細(xì)胞突變基因檢測(cè)系統(tǒng)，按照上市前審批（PMA）管理。目前我國(guó)該類上市產(chǎn)品已有十幾家。檢測(cè)人EGFR突變基因的方法學(xué)主要有位點(diǎn)特異PCR熒光探針法、基因測(cè)序法、數(shù)字PCR法等，不同方法學(xué)之間在檢測(cè)性能方面也存在明顯差異[7-10]。

2 人EGFR突變基因檢測(cè)試劑申報(bào)過程中常見問題

2.1 人EGFR突變基因檢測(cè)試劑說明書預(yù)期用途

目前申報(bào)該類產(chǎn)品說明書中存在預(yù)期用途指向不明確，表述不清晰等問題。申請(qǐng)人需規(guī)范預(yù)期用途表述形式，結(jié)合該類產(chǎn)品臨床評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)與個(gè)體化診療藥物聯(lián)合治療情況客觀描述產(chǎn)品預(yù)期用途。依據(jù)《體外診斷試劑產(chǎn)品說明書指導(dǎo)原則》要求，預(yù)期用途需明確該類型產(chǎn)品樣本類型，生物學(xué)標(biāo)志物，定性或定量等內(nèi)容。申請(qǐng)人需規(guī)范EGFR不同突變基因型別表達(dá)形式，明確產(chǎn)品外顯子、突變位點(diǎn)、cosmic代碼等信息。

申請(qǐng)人需針對(duì)自身完成的藥物診療個(gè)體化伴隨檢測(cè)研究工作，明確申報(bào)產(chǎn)品是否聯(lián)合伴隨藥物進(jìn)行聯(lián)合臨床研究。對(duì)于申報(bào)試劑伴隨具體治療藥物聯(lián)合進(jìn)行臨床試驗(yàn)研究，并證明兩者伴隨使用具有顯著的臨床治療意義，需在說明書中明確具體藥物及生產(chǎn)企業(yè)，并簡(jiǎn)要介紹相關(guān)臨床患者受益情況。如靶基因突變與腫瘤疾病及治療方案的相關(guān)性描述來自治療指南、書籍、文獻(xiàn)等資料，則在本項(xiàng)下注明參考資料的出處。

產(chǎn)品說明書預(yù)期用途中，申請(qǐng)人需對(duì)EGFR突變基因檢測(cè)進(jìn)行臨床背景介紹，包括檢測(cè)相關(guān)適用人群特征、腫瘤組織樣本類型、EGFR突變基因序列相關(guān)信息，EGFR突變基因及其表達(dá)蛋白在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能起到作用，相關(guān)藥物或其他治療技術(shù)及其作用機(jī)理、與待測(cè)突變位點(diǎn)可能存在關(guān)系等[11]。

2.2 人EGFR突變基因檢測(cè)試劑臨床研究

研究表明[12]，EGFR突變基因被檢測(cè)人群之間存在種族差異。亞裔人群中非小細(xì)胞癌患者EGFR突變基因陽性率明顯高于高加索人群EGFR突變基因陽性率。但目前我國(guó)人群腫瘤突變基因數(shù)據(jù)庫(kù)相對(duì)缺乏，無論是境外申請(qǐng)人還是境內(nèi)申請(qǐng)人進(jìn)行人EGFR突變基因檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)前均需完成我國(guó)境內(nèi)臨床研究資料，滿足《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》要求，且每種基因型需完成一定病例數(shù)的陽性樣本。盡管人EGFR常見敏感突變基因在肺腺癌中是EGFR-TKIs的陽性預(yù)測(cè)標(biāo)志物，但罕見EGFR突變基因流行病學(xué)以及對(duì)預(yù)后和TKIs療效的影響是未知的[13]。在臨床試驗(yàn)過程中，如申報(bào)產(chǎn)品中部分突變基因類型未在非小細(xì)胞肺癌人群中檢出，可能與該部分突變基因在我國(guó)人群突變頻率較低或總樣本人群選擇存在偏倚有關(guān)。針對(duì)該類問題，建議申請(qǐng)人擴(kuò)大臨床樣本人群或根據(jù)不同突變基因突變頻率特點(diǎn)，增加不同地域的臨床研究機(jī)構(gòu)，提高這部分突變基因陽性檢出率。

2.3 人EGFR突變基因檢測(cè)試劑檢測(cè)人外周血樣本

目前申報(bào)產(chǎn)品中最為常見的樣本類型以中性福爾馬林固定石蠟包埋病理組織(FFPF)為主，且FFPF是獲取腫瘤突變基因信息的主要方式，但大部分晚期非小細(xì)胞肺癌患者已失去手術(shù)機(jī)會(huì)或因其他原因不能獲取腫瘤FFPF樣本。研究結(jié)果表明，隨著腫瘤細(xì)胞的凋亡，腫瘤游離DNA（ctDNA）片段釋放到人體血液循環(huán)中，通過對(duì)外周血腫瘤游離DNA的檢測(cè)解讀，可以更好地了解腫瘤病情的發(fā)展情況以及尋找適合的治療方案，尤其對(duì)于那些無法通過手術(shù)取得腫瘤組織或希望在治療后對(duì)病情進(jìn)行跟蹤隨訪的人群，是一種理想和有效的檢測(cè)手段。病理組織和外周血樣本相比，主要相同點(diǎn)在于臨床肺癌晚期病人中采集同源性病理組織樣本和外周血樣本均能檢測(cè)EGFR突變基因。但由于血液游離DNA含量及變異情況會(huì)隨著腫瘤病情的發(fā)展、轉(zhuǎn)移性腫瘤的發(fā)生、以及用藥治療情況發(fā)生實(shí)時(shí)的變化，外周血檢測(cè)EGFR突變基因檢測(cè)結(jié)果存在一定的不確定性。兩種樣本在用于人肺癌的分子靶向治療（EGFR-TKI）治療效果也存在差異。

鑒于上述原因，人EGFR突變基因檢測(cè)試劑如適用于外周血樣本檢測(cè)人群，預(yù)期用途需限定為晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）樣本患者，且作為不能獲取NSCLC樣本時(shí)的補(bǔ)充手段。鑒于病理組織樣本和外周血樣本中EGFR突變基因比例不同，申報(bào)產(chǎn)品需分別滿足檢測(cè)外周血樣本和病例組織樣本最低檢出限要求。

2.4 人EGFR突變基因檢測(cè)試劑適用樣本采集儲(chǔ)存

病理組織樣本需詳細(xì)介紹組織學(xué)樣本類型，包括樣本來源及取材要求、組織標(biāo)本采集厚度、樣本處理方式（如組織樣本的固定及包埋方式）、腫瘤細(xì)胞比例等。在進(jìn)行核酸序列檢測(cè)前，需對(duì)用于腫瘤組織突變基因檢測(cè)的標(biāo)本進(jìn)行確認(rèn)，并富集可能存在突變基因的腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞所占比例需達(dá)到所用擴(kuò)增檢測(cè)方法的要求。

外周血樣本采集后，需規(guī)定外周血樣本存放條件以及對(duì)存放時(shí)限及溫度設(shè)置等進(jìn)行驗(yàn)證，包括采用加入抗核酸降解的采血管要求。樣本采集管保存管中所用的防腐劑、抗凝劑、保護(hù)劑等輔助成分不應(yīng)對(duì)基因序列擴(kuò)增產(chǎn)生干擾。血液通常需要先進(jìn)行抗凝保存，抗凝劑的選擇很重要。申請(qǐng)人需對(duì)抗凝劑、防腐劑、保護(hù)劑等成分進(jìn)行驗(yàn)證。

因晚期肺癌患者外周血樣本中EGFR突變基因含量相對(duì)較少，建議增加外周血樣本提取總量和采取相應(yīng)富集的方式進(jìn)行核酸提取純化。從而保證外周血樣本中EGFR基因片段被提取的機(jī)率增大。同時(shí)，需保證核酸提取工藝，減少核酸損耗和降解。申請(qǐng)人需對(duì)外周血全血保存時(shí)間及溫度，離心參數(shù)設(shè)置等進(jìn)行驗(yàn)證。因ctDNA含量低，為提高EGFR突變基因檢出率，在患者身體條件允許的情況下，推薦增加血漿采集量。抽血后需盡快分離血漿，延遲血漿分離將導(dǎo)致血液中血細(xì)胞的裂解，釋放出大量人基因組DNA（gDNA）至血漿中；增加的gDNA會(huì)稀釋腫瘤細(xì)胞來源的ctDNA，使得突變基因難以檢出。因此，在外周血標(biāo)本收集、運(yùn)輸及貯存過程中，需有效避免游離DNA降解；同時(shí)，還需防止血液中白細(xì)胞裂解，避免因野生型游離DNA增加導(dǎo)致ctDNA中EGFR突變基因比例變小，可能導(dǎo)致EGFR突變基因檢測(cè)結(jié)果假陰性[14]。

2.5 人EGFR突變基因試劑注冊(cè)申報(bào)中其他常見問題

2.5.1 人EGFR突變基因檢測(cè)試劑產(chǎn)品技術(shù)要求

申請(qǐng)人在設(shè)置企業(yè)內(nèi)部參考品時(shí)，因考慮不同樣本類型之間存在的差異情況，根據(jù)不同樣本類型及突變基因型分別設(shè)置企業(yè)內(nèi)部參考品。申請(qǐng)人在制定產(chǎn)品技術(shù)要求時(shí)，也需考慮不同樣本類型及不同突變基因型的性能評(píng)價(jià)要求和檢驗(yàn)方法。

2.5.2 申請(qǐng)樣本類型許可事項(xiàng)變更事項(xiàng)

如申請(qǐng)人在人EGFR注冊(cè)產(chǎn)品原有病理組織樣本檢測(cè)基礎(chǔ)上增加外周血樣本類型，申請(qǐng)人需考慮外周血樣本類型與病理組織樣本類型中人EGFR突變基因片段長(zhǎng)度，樣本中EGFR突變基因比例等差異。申請(qǐng)人需依據(jù)法規(guī)要求提交適用樣本變更申報(bào)資料，同時(shí)還需提交申報(bào)試劑擴(kuò)增反應(yīng)體系性能研究、適用于外周血樣本的人EGFR突變基因檢測(cè)試劑分析性能評(píng)價(jià)、外周血樣本保存及處理等研究資料。

3 結(jié)論

人EGFR突變基因檢測(cè)目前是EGFR-TKIs治療的重要檢測(cè)靶點(diǎn)，隨著核酸檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，如：BEAMing技術(shù)、數(shù)字PCR、高通量測(cè)序技術(shù)運(yùn)用于腫瘤個(gè)體化治療相關(guān)突變基因檢測(cè)越來越受到臨床專家和行業(yè)研究人員的關(guān)注。面對(duì)目前臨床常規(guī)成熟且推薦的檢測(cè)技術(shù)，新的檢測(cè)技術(shù)如何定位。臨床個(gè)體化應(yīng)用與臨床個(gè)體化研究?jī)烧叽嬖诓町?，臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究如何有效轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，都將是今后注冊(cè)審評(píng)關(guān)注重點(diǎn)。產(chǎn)品使用過程中也不能忽視操作人員對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響。從樣本采集及預(yù)處理、檢測(cè)過程中防污染措施、檢測(cè)結(jié)果多因素分析等，都需要有經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員操作。因此，對(duì)操作人員的相關(guān)培訓(xùn)不能忽視。希望通過本文對(duì)人EGFR突變基因檢測(cè)試劑申報(bào)過程中常見問題的梳理，幫助申請(qǐng)人減少注冊(cè)申報(bào)資料中的問題，提升該類產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料質(zhì)量。

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Resolved Problems of EGFR Mutation Detection Reagent Registration Application

【 Writers 】WU Chuansong1, HUANG Jie2, AN Juanjuan1, DENG Gang1
1 Center for Medical Devices Evaluation of CFDA, Beijing, 100044 2 National Institute for Food and Drug Control, Beijing, 100050

human epidermal growth factor receptor, gene mutation

widespread attention. In this paper, through analyzing the common problems of human EGFR gene mutation detection reagent present during the past registration application. This paper describes a solution of such problems. We hope to provide information and help for relevant personnel engaged in such products registration application.

1671-7104(2017)04-0289-03

2016-11-25

吳傳松，E-mail: cswu2010@126.com

F203；R362

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2017.04.015

【 Abstract 】Cancer treatment-related gene mutation detection reagent develops rapidly especially, human Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) gene mutation as a molecular target for cancer therapy has