譚小玉

【摘 要】 目的：建立海南黎藥白花丹的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法對(duì)海南黎藥白花丹的藥材進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法測(cè)定白花丹中的白花丹醌的含量，并對(duì)白花丹的水分、灰分、浸出物進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：初步建立了海南黎藥白花丹薄層色譜鑒別方法和含量測(cè)定高效液相色譜法，并分別測(cè)定了白花丹根、莖、葉的水分、灰分和浸出物。其中莖部分白花丹醌的含量約為葉部分的白花丹醌含量的10倍，根、莖、葉水分含量差別不大，葉中總灰分和酸不溶性灰分比其他部位高，白花丹葉浸出物的測(cè)定結(jié)果為根、莖浸出物的2倍。結(jié)論：所建立的方法準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定，可為制定黎藥白花丹質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考，測(cè)定結(jié)果為進(jìn)一步利用白花丹藥材提供借鑒。

【關(guān)鍵詞】 白花丹；薄層色譜鑒別；白花丹醌；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

【中圖分類號(hào)】R248.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2016）24-0021-04

Abstract：Objective To study quality standards for Plumbago zeylanica L.. Methods Plumbago zeylanica L.wasidentified by TLC methods. The plumbagin content of Plumbago zeylanica L. was determined by HPLC. Determination of moisture， ash and extractives were studies. Results Preliminary study on Quality Standards of Plumbago zeylanica L.. TLC identification and quantitative method for the determination of plumbagin by HPLC were established.Determination of the moisture， ash and extractives from roots， stems and leaves respectively. The plumbagin content of stems is about 10 times of leaves. Results of moisture is not different in roots，stems and leaves. Total ash and acid-insoluble ash of leaves is higher than other parts. Extractives of leaves is twice of roots and stems. Conclusion The method s accurate， reliable and stability can be used for the quality standards of Plumbago zeylanica L..The results can be used to further study.

Keywords：Plumbago zeylanica L.； TLC； Plumbagin； Quality Standards

白花丹Plumbago zeylanica L.是白花丹科（Plumbaginaceae）白花丹屬（Plumbago）植物，又名白花藤（唐本草），烏面馬（臺(tái)灣），白花謝三娘、天山娘、一見(jiàn)不消（海南），照藥、耳丁藤、猛老虎（廣西），白花金絲巖陀、白花九股牛（云南），白皂藥（四川）[1]。白花丹為常綠半灌木，高約1～3m，開(kāi)小白花。海南黎族、廣西壯族、云南傣族及哈尼族、廣西瑤族、維吾爾族等均有將其干燥的根、莖、葉或全草入藥使用的傳統(tǒng)。用法上即可單味入藥，也有見(jiàn)組成復(fù)方，常用于治療跌打損傷、散瘀消腫、皮膚瘙癢、體癬等癥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白花丹具有抗菌抗炎[2]、抗腫瘤[3]、抗肝損傷及肝纖維化[4]、殺螨[5]等活性。特別是白花丹的提取物白花丹醌在抗腫瘤方面顯示出重要的研究?jī)r(jià)值[6]。為了更好地進(jìn)行保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用，本文就采集于海南各市縣的白花丹進(jìn)行初步的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，為今后的標(biāo)準(zhǔn)制定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 藥材 白花丹各采自海南省市縣，藥材來(lái)源詳見(jiàn)表1。

1.2 材料 白花丹醌對(duì)照品（批號(hào)：SLBG3436V，美國(guó)SIGMA公司）；甲醇（色譜純，批號(hào)：1696207331，德國(guó)默克）、甲醇（分析純，批號(hào)：131215-5，西隴化工股份有限公司）；三氯甲烷（分析純，批號(hào)：20130701-2，廣州化學(xué)試劑廠）；石油醚（30～607）（分析純，批號(hào)：20140101-2，廣東光華科技有限公司）；乙酸乙酯（分析純，批號(hào)：20140401-2，西隴化工股份有限公司）；冰乙酸（分析純，批號(hào)：20141102-2，廣州化學(xué)試劑廠）；氨水（分析純，批號(hào)：141207，西隴化工股份有限公司）；鹽酸（分析純，批號(hào)：140205-1，汕頭市西隴化工廠有限公司）；95%乙醇（分析純，批號(hào)：20141227-1，廣州化學(xué)試劑廠）；水為超純水。

1.3 儀器 箱式電阻爐（上海華聯(lián)環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備公司恒昌儀器廠）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）； BP211D精密電子天平（Sartorious）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；島津LC-2010CHT高效液相色譜儀。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別 取白花丹粉末5g，加甲醇50mL，回流提取 30min，放冷，濾過(guò)，取濾液加入50mL水，混勻后，用三氯甲烷振搖提取2次，每次50mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)?mL甲醇使溶解，作為供試品溶液。另取白花丹醌對(duì)照品，用甲醇配制成 0.1mg/mL 的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015 年版四部通則0502）試驗(yàn)，供試品溶液15驗(yàn)，對(duì)照品溶液10照品，分別點(diǎn)于同一硅膠 G 薄層板上，以石油醚（30～60以）-乙酸乙酯-冰乙酸 （ 10∶1∶0.5） 為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。置氨水蒸氣中熏至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在于對(duì)照品相應(yīng)的位置上，顯相同的紫色斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取白花丹醌對(duì)照品10mg置于100mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲微熱使之溶解，待冷卻后加入甲醇定容，搖勻后配制成0.1mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備取白花丹藥材粉末（過(guò)三號(hào)篩）1g，精密稱定，置于100mL具塞錐形瓶中，加入20mL的甲醇，稱定其總重量。回流提取30min，放冷后補(bǔ)足重量，過(guò)濾并取續(xù)濾液5mL至10mL容量瓶中，用甲醇定容，過(guò)0.45，用濾膜，作為供試品溶液。

2.2.3 色譜條件 島津Lab solution工作站；C18色譜柱（250mm×4.6mm，54.）；以甲醇-水（60∶40）為流動(dòng)相；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)270nm；柱溫25；進(jìn)樣量10μL。在上述色譜條件下白花丹醌達(dá)到基線分離且與鄰峰分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于5000。對(duì)照品及樣品的 HPLC 圖，見(jiàn)圖2。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精及線性范圍考察 精密量取白花丹醌對(duì)照品溶液0.2、1、2、5、10、25μg/mL分別置于50μg/mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，即得濃度分別為0.4、2、4、10、20、50μg/mL的白花丹對(duì)照品溶液，按“2.2.3”色譜條件依次進(jìn)樣10μg/mL，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程得：Y=43308X-5715.4（r=0.9996）。結(jié)果表明：白花丹醌在0.4～50μg/mL白范圍內(nèi)呈良好的線形關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一濃度的白花丹醌對(duì)照品溶液10μL，按“2.2.3”色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果按白花丹醌峰面積計(jì)算，RSD為0.29%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10μg/mL，分別在制備后 0、2、4、8、10、12、24h 進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定白花丹醌峰面積的RSD值為 0.82%。表明樣品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次白花丹粉末6份各1g（過(guò)三號(hào)篩），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定白花丹醌的峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果RSD為1.84%。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批次白花丹全草粉末6份，各0.5g（過(guò)三號(hào)篩），精密稱定，別精密加入一定量的白花丹醌對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.9 樣品測(cè)定 精密稱取不同產(chǎn)地的三批白花丹全草粉末（過(guò)三號(hào)篩）各1g于100mL容量瓶中，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。同法分別測(cè)定不同產(chǎn)地的白花丹樣品中葉和莖部分的白花丹醌含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

通過(guò)表3可知，白花丹植物莖和葉部分白花丹醌含量差別較大，莖部分白花丹醌的含量約為葉部分的白花丹醌含量的10倍。三個(gè)不同產(chǎn)地的白花丹樣品全草、葉、莖部分白花丹醌含量略有區(qū)別，其中五指山地區(qū)產(chǎn)的白花丹白花丹醌含量略高。

2.3 檢查 按《中國(guó)藥典》2015版四部通則0832第二法（烘干法）、通則2302、通則2201分別對(duì)3批白花丹根、莖、葉的水分、灰分（總灰分和酸不溶性灰分）、浸出物（水溶性浸出物和醇溶性浸出物）進(jìn)行測(cè)定。由表4、5、6可知，根、莖、葉水分含量差別不大。其中葉的水分含量較高，最高值為13.56%，莖的水分含量較低，最低值為9.39%。不同產(chǎn)地間白花丹的總灰分和酸不溶性灰分差別不大，但是整體上葉中總灰分和酸不溶性灰分均遠(yuǎn)大于根、莖中的總灰分和酸不溶性灰分，其中葉的總灰分最高值為14.17%；酸不溶灰分最高值為1.02%。根的總灰分和酸不溶性灰分的最大值分別為3.05%和0.44%。莖的總灰分和酸不溶性灰分的最大值分別為5.30%和0.31%。白花丹根的水溶性浸出物（熱浸法）最低值為10.10%；醇溶性浸出物最低值為5.28%；莖的水溶性浸出物（熱浸法）最低值為12.76%；醇溶性浸出物最低值為4.21%；葉的水溶性浸出物（熱浸法）最低值為21.41%；醇溶性浸出物最低值為6.86%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分別考察了乙酸乙酯-石油醚（30～60℃）、石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯-冰醋酸、三氯甲烷-甲醇、石油醚（30～60℃）-丙酮等不同薄層展開(kāi)體系，結(jié)果表明石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯-冰乙酸 （10∶1∶0.5）作為展開(kāi)劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分離度好，斑點(diǎn)相對(duì)位置和重復(fù)性好。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取溶劑（甲醇、三氯甲烷）、提取方法（超聲、回流提?。⑻崛r(shí)間進(jìn)行考察，最終建立了白花丹藥材中白花丹醌的HPLC定量測(cè)定的方法為20mL甲醇，回流提取30min。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)采集的白花丹進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)海南境內(nèi)不同產(chǎn)地的白花丹中白花丹醌的含量略有差別，而且葉、莖、全草中白花丹醌的含量差別較大（根因采集數(shù)量過(guò)少未做含量測(cè)定），莖部分白花丹醌的含量約為葉部分的白花丹醌含量的10倍，為后續(xù)開(kāi)發(fā)藥材提供指導(dǎo)，若需要提取白花丹中白花丹醌成分最好選擇莖部分。

本實(shí)驗(yàn)采用國(guó)家藥典方法，對(duì)藥材的水分、灰分、浸出物進(jìn)行檢查，根據(jù)所測(cè)結(jié)果可知，白花丹根、莖、葉水分差別不大，為了更好地控制藥材質(zhì)量，建議水分不得過(guò)15%；葉中總灰分和酸不溶性灰分均遠(yuǎn)大于根、莖中的總灰分和酸不溶性灰分，因單獨(dú)制定葉中的總灰分不得過(guò)16%，酸不溶性灰分不得過(guò)1.1%；根或莖的總灰分不得過(guò)6.0%，酸不溶性灰分不得過(guò)0.5%；白花丹葉浸出物的測(cè)定結(jié)果為根、莖浸出物的2倍，故暫擬定，白花丹葉水溶性浸出物（熱浸法）不得低于18%，醇溶性浸出物（95%乙醇）不得低于5.8%；根或莖水溶性浸出物（熱浸法）不得低于9.0%，醇溶性浸出物（95%乙醇）不得低于3.5%。

綜上，實(shí)驗(yàn)建立的海南黎藥白花丹藥材的定性、定量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠，可為黎藥白花丹質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供一定的參考。

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（編輯：梁志慶）