厲 妲，高云龍，何婉婉，康廷國

(1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600；2 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；3 中國人民大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，北京 100872)

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紅花及其白花變種中羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定

厲 妲1,2，高云龍3，何婉婉1，康廷國1

(1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600；2 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；3 中國人民大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，北京 100872)

用HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地紅花及其白花變種中羥基紅花黃色素A的含量，采用高效液相色譜法測(cè)定羥基紅花黃色素A的含量。研究發(fā)現(xiàn)，HPLC法測(cè)得紅花中羥基紅花黃色素A的含量均大于1.00%，白花變種中羥基紅花黃色素A的含量為0%。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地紅花中羥基紅花黃色素A的含量不同，而白花變種中不含羥基紅花黃色素A，這為紅花優(yōu)良品種及紅花和紅花的白花變種藥用價(jià)值評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

紅花；紅花變種；羥基紅花黃色素A；含量測(cè)定

紅花為菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花，主產(chǎn)于河南、河北、浙江、四川、新疆等地，作為傳統(tǒng)的活血化瘀類中藥，其具有活血通經(jīng)、散瘀止痛之功效；紅花又有食用、油料、染料和飼料等用途，是一種應(yīng)用極為廣泛的植物資源[1-3]。紅花主要藥效成分為黃酮類化合物。其中, 紅花起活血化瘀作用的主要成分是紅花黃色素，而羥基紅花黃色素A是紅花中紅花黃色素的主要指標(biāo)性成分。河南是紅花的主要產(chǎn)區(qū)之一,紅花的變種白花是河南省衛(wèi)輝市鑫福林衛(wèi)紅花種植專業(yè)合作社培育。為了更進(jìn)一步研究其藥用價(jià)值, 作者在對(duì)紅花進(jìn)行顯微和化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上, 采用HPLC法測(cè)定了紅花及紅花變種白花中羥基紅花黃色素A的含量, 為紅花優(yōu)良品種的選育、紅花及白花變種的藥用價(jià)值評(píng)價(jià)提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Agilent 1200高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；Bransonic超聲提取儀；FW80高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；CP225D電子分析天平，Satorius。

1.2 試劑與試藥

甲醇、磷酸、乙腈均為色譜級(jí)純，上述試劑均為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；水為純凈水；其余試劑為分析純。羥基紅花黃色素A對(duì)照品(批號(hào)分別為: 111637-201207)購于中國藥品生物制品檢定研究院。紅花(CarthamustinctoriusL.)樣品及其白花變種的樣品,具體來源見表1。

表1 樣品來源

續(xù)表1

4紅花浙江省寧波市5紅花新疆維吾爾自治區(qū)烏什縣6紅花河南省新鄉(xiāng)市7紅花北京市中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所植物園8紅花遼寧省沈陽市沈陽藥科大學(xué)藥草園9～14紅花河南省新鄉(xiāng)市衛(wèi)輝市安都鄉(xiāng)莊和村種植基地15～20白花變種河南省新鄉(xiāng)市衛(wèi)輝市安都鄉(xiāng)莊和村種植基地

2 方法與結(jié)果[3]

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性條件

色譜柱：Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液( 26:2:72 )；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長：403 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL[1]。結(jié)果見圖1。

圖1 對(duì)照品(a)及樣品(b) HPLC圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取羥基紅花黃色素A，加25%的甲醇溶液配制成質(zhì)量濃度為0.13 mg/mL的羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

分別取20批紅花樣品粉末約 0.4 g(過三號(hào)篩),精密稱定后置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 的25%甲醇溶液，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)40 min，放冷，再稱定重量，用25%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過微孔濾膜(0.45 μm)，即得供試品溶液。

2.4 測(cè)定法

精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定并記錄色譜峰面積，計(jì)羥基紅花黃色素A的含量。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系的考察

精密稱取羥基紅花黃色素A的對(duì)照品3.25 mg，置25 mL棕色容量瓶中，加25%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后制成每1 mL含0.1203 mg的溶液。分別精密吸取4、6、8、10、12、14 μL所配溶液，注入液相色譜器儀中，測(cè)定色的譜峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：橫坐標(biāo)為羥基紅花黃色素A的進(jìn)樣量，縱坐標(biāo)為色譜的峰面積，經(jīng)線性回歸，所得的回歸方程為：y=348.73x+6.947，r=0.9998，在0.48～1.48 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取配好的羥基紅花黃色素A的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定色譜峰面積。RSD=0.67%。測(cè)定結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)的精密度試驗(yàn)符合規(guī)定。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取紅花1號(hào)粉末0.4 g(100目)，精密稱定，按供試品溶液制備方法配制供試液，精密吸取供試液，按0、2、4、6、8、10 h時(shí)間間隔，分別進(jìn)行進(jìn)樣分析，測(cè)定色譜峰面積，RSD=0.55%，試驗(yàn)結(jié)果：供試液在制備后10 h內(nèi)測(cè)定時(shí)色譜峰的面積無明顯變化，證明在此時(shí)間內(nèi)，待測(cè)組分的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定不變。

2.5.4 重復(fù)性考察

紅花1號(hào)粉末0.4 g(100目)，精密稱定，按供試品溶液制備方法配制供試液，精密吸取供試液，制備方法操作，并測(cè)定，分別計(jì)算羥基紅花黃色素A的平均含量及相應(yīng)的RSD 值。結(jié)果平均含量為1.17%，RSD 值為1.5%。表明方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法，取已知含量(羥基紅花黃色素A含量為1.17 mg/g)紅花樣品六份，精密稱定，分別精密加入羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液(0.1203 mg/mL)2 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,測(cè)定并計(jì)算回收率。所得平均加樣回收率為100.98% ,RSD= 1.22%。本方法羥基紅花黃色素A的回收率95.0%～105.0%之間，符合有關(guān)規(guī)定。羥基紅花黃色素A回收率的試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 回收率考察結(jié)果

2.6 樣品含量測(cè)定

取紅花對(duì)照品及各樣品供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。峰面積測(cè)定結(jié)果及羥基紅花黃色素A含量結(jié)果見表3。

表3 紅花及其白花變種樣品中含有羥基紅花黃色素A的量

3 討 論

不同產(chǎn)地紅花中羥基紅花黃色素A的含量比較，在收集的6個(gè)省14個(gè)不同批次紅花中，遼寧省與河南省紅花中的含量普遍高于其他產(chǎn)地，這與傳統(tǒng)認(rèn)為河南為紅花的道地藥材產(chǎn)地相符；新疆產(chǎn)紅花中羥基紅花黃色素A成分含量低于其他產(chǎn)地，這與傳統(tǒng)認(rèn)為新疆為紅花的道地藥材不相符，這可能與當(dāng)年的土壤成分、氣候環(huán)境、種植過程、采收過程、產(chǎn)地加工方法以及生態(tài)環(huán)境等因素有關(guān)，有待進(jìn)一步考察研究[4]。

本實(shí)驗(yàn)的白色變種紅花是由衛(wèi)輝市鑫福林衛(wèi)紅花種植專業(yè)合作社與航天科技育種中心合作研發(fā)培育而成，它的化學(xué)成分與其母本紅花有很大的差別, 本實(shí)驗(yàn)對(duì)紅花及其白花變種中的羥基紅花黃色素A進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明紅花的白花變種中不含羥基紅花黃色素A(HSYA)。曾有研究表明: CT-wpr 基因可能對(duì)和HSYA 相關(guān)的基因起調(diào)節(jié)修飾作用，從而導(dǎo)致該基因的失活或活化，最終使HSYA 在白花中不表達(dá)[5]。

紅花中的主要藥效成分為黃酮類化合物。其中, 紅花黃色素是紅花起活血化瘀作用的主要成分，有研究表明，在紅花黃酮類代謝途徑中起作用的關(guān)鍵酶有黃酮醇合酶，查爾酮合酶，查爾酮異構(gòu)酶，二羥基黃酮醇還原酶以及糖基轉(zhuǎn)移酶等[6,7]。以本研究為基礎(chǔ)可以對(duì)紅花中黃酮類化學(xué)成分以及紅花中黃酮代謝途徑中的關(guān)鍵酶進(jìn)行深入研究。

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典.一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:151.

[2] 康廷國.中藥鑒定學(xué)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2012:285.

[3] 厲妲,張靜,張建逵,等.紅花顯微特征常數(shù)與化學(xué)成分相關(guān)性[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,20(19): 57-60.

[4] 厲妲,梁鸝,張靜,等.不同產(chǎn)地、不同采收期款冬花的質(zhì)量評(píng)價(jià)[J].中藥材,2015,38(4):720-722.

[5] 童文,孫佩,楊曉,等.紅花花色與羥基紅花黃色素A 的相關(guān)性初探[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,24(1):101-104.

[6] 劉飛.紅花黃酮類化合物生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的克隆與功能驗(yàn)證[D].上海:第二軍醫(yī)大學(xué),2014.

[7] 于丹,成禹杉,胡尚欽,等.紅花及其白花變種中總黃酮及山柰酚-3-O-蕓香糖苷的含量測(cè)定[J].華西藥學(xué)雜志,2010(06):751-753.

Determination of Hydroxy Safflor Yellow A inCarthamiFlosandCarthamiFlosVatiety Named White Flower

LIDa1,2,GAOYun-long3,HEWan-wan1,KANGTing-guo1

(1 China College of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Liaoning Dalian 116600;2 College of Chinese Pharmacy, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102;3 Department of Chemistry, Renmin University of China, Beijing 100872, China)

The HPLC method was established for determination of Hydroxy Safflor Yellow A of safflower and safflowe vatiety named white flower from different areas. The content of Hydroxy Safflor Yellow A was 1.0% inCarthamiFlosand 0.0% in the vatiety. The contents of Hydroxy Safflor Yellow A from different areas were different.CarthamiFlosvatiety named white flower did not contain Hydroxy Safflor Yellow A. The study is comprehensive for evaluating the quality ofCarthamiFlosandCarthamiFlosvatiety named white flower, can be used as a basis for finding better breeding of superior varieties ofCarthamiFlos.

CarthamiFlos;CarthamiFlosvatiety; Hydroxy Safflor Yellow A; determination

厲妲(1989-)，女，在讀博士研究生,主要從事中藥鑒定與品質(zhì)評(píng)價(jià)及分子生藥學(xué)。

康廷國(1955-)，男，博士研究生導(dǎo)師，教授，主要從事中藥鑒定與品質(zhì)評(píng)價(jià)。

R284 1

A

1001-9677(2016)024-0090-03