楊俊花 趙志輝 郭文博 郭晉麗

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海201403)

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應(yīng)用Illumina-MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分析脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對(duì)小鼠腸道菌群的影響

楊俊花 趙志輝*郭文博 郭晉麗

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海201403)

本試驗(yàn)旨在研究脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)對(duì)小鼠腸道微生物多樣性、物種豐度的影響。選用平均體重為20 g的BALB/c小鼠40只，隨機(jī)分成對(duì)照組(灌胃滅菌生理鹽水)和DON組(灌胃1.8 mg/kg BW DON)，每組20個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只小鼠，連續(xù)灌服28 d。試驗(yàn)結(jié)束后，收集新鮮糞便，每組隨機(jī)選取3份，用Illumina-MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分析微生物群落結(jié)構(gòu)和組成的變化。結(jié)果表明，1)與對(duì)照組相比，DON組測(cè)序數(shù)量減少(P>0.05)。2)DON組降低了Alpha、Beta多樣性，Shannon指數(shù)較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。3)在門(mén)水平，與對(duì)照組相比，DON組顯著降低了擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和脫鐵桿菌門(mén)(Deferribacteres)的物種豐度(P<0.05)，顯著提高了變形菌門(mén)(Proteobacteria)的物種豐度(P<0.05)。在屬水平，與對(duì)照組相比，DON組顯著降低了副類(lèi)桿菌屬(Parabacteroides)、理研菌屬(Rikenella)、Algoriphagus、Mucispirillum、嗜甲基菌屬(Methylophilus)、Francisella的物種豐度(P<0.05)，顯著提高了梭菌屬(Clostridium)、Robinsoniella、Allobaculum、Akkermansia的物種豐度(P<0.05)。4)聚類(lèi)分析顯示，DON組與對(duì)照組的腸道微生物相似性降低。由此可見(jiàn)，DON能顯著影響小鼠腸道微生物菌群多樣性及物種豐度，提示DON致腸道損傷與這些腸道菌群的變化密切相關(guān)。

高通量測(cè)序；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；腸道微生物

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)是由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)等在適宜的溫度和濕度條件下產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，主要存在以小麥、玉米為基礎(chǔ)的食物和飼料中[2]。研究指出，DON毒性雖低于其他真菌毒素，但由于污染普遍、含量高，對(duì)人畜具有非常高的危害性[3]。誤食極易引起厭食、嘔吐、腹痛、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)和反應(yīng)遲鈍等癥狀，長(zhǎng)期暴露易導(dǎo)致腸道功能紊亂、生長(zhǎng)緩慢、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)損傷、休克死亡等[4-5]，給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

腸道作為機(jī)體與外界物質(zhì)接觸的第一道屏障，不僅可以阻止異型生物質(zhì)如飼料蛋白質(zhì)、天然毒素、微生物以及真菌毒素等的入侵，同時(shí)也極易成為外源性物質(zhì)的攻擊靶標(biāo)。近年來(lái)，許多研究都集中在DON對(duì)腸道功能的影響，發(fā)現(xiàn)DON可損傷腸道黏膜、破壞腸道屏障和細(xì)胞緊密連接、引起腸道炎癥、降低腸道免疫應(yīng)答、阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收等[6-7]。

腸道菌群作為腸道重要的組成部分，被譽(yù)為是機(jī)體自身的黑匣子，其一切的生命活動(dòng)和代謝情況，如屏障功能、營(yíng)養(yǎng)作用、免疫應(yīng)答等都與健康密切相關(guān)[8]。然而，目前DON對(duì)腸道微生物的影響國(guó)內(nèi)外研究鮮有報(bào)道。體外試驗(yàn)表明，DON不影響金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和結(jié)腸炎耶爾森桿菌的生長(zhǎng)，只對(duì)鏈球菌有抑制作用[9]。Waché等[10]研究表明，給豬飼喂DON污染的飼糧可增加厭氧菌的數(shù)量，降低厭氧性亞硫酸鹽還原菌的數(shù)量；Saint-Cyr等[11]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠灌胃DON可顯著降低糞便中大腸桿菌的數(shù)量。但這些研究主要基于體外培養(yǎng)法、毛細(xì)管電泳-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(CE-SSCP)法和熒光定量PCR法，并不能充分反映DON對(duì)腸道菌群的作用，只局限于一定豐度細(xì)菌或特定微生物，對(duì)未知微生物均未涉及。因此，本研究選擇高通量數(shù)據(jù)、高檢測(cè)深度和高準(zhǔn)確率的宏基因組測(cè)序技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析技術(shù)，旨在定性、定量地研究DON對(duì)小鼠腸道結(jié)構(gòu)組成、菌群多樣性和豐度等各方面的影響，探索DON致腸道炎癥、損傷以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收障礙的作用機(jī)制，篩選腸道暴露DON的敏感菌群和微生物標(biāo)志物，為飼糧中真菌毒素污染安全評(píng)價(jià)探索新的路徑和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

DON標(biāo)準(zhǔn)品：粉末狀，純度≥99%(Pribolab，Singapore)，購(gòu)自北京普華仁生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，以高壓滅菌水稀釋。糞便DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

主要儀器：Illumina-MiSeq DNA測(cè)序儀(Illumina，美國(guó))、紫外分光光度計(jì)(Shimadzu，日本)、Sorvall高速離心機(jī)(Thermo，美國(guó))、PCR儀(Bio-Red，美國(guó))、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Red，美國(guó))。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

BALB/c小鼠40只，6周齡，體重18～22 g，無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)，購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。室溫維持(23±2) ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，光照周期12 h，自由飲水和采食，提供高壓滅菌蒸餾水和經(jīng)1.5～2.5 Mrad鈷-60照射除菌的飼料，預(yù)飼喂1周。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將40只小鼠隨機(jī)分成2組，每組20個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只小鼠，分籠飼養(yǎng)在無(wú)菌隔離器中。分為對(duì)照組(灌胃滅菌生理鹽水)和DON組(灌胃1.8 mg/kg BW DON)，試驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)參考DON對(duì)BALB/c小鼠的急性、亞急性毒性結(jié)果[15]，每只小鼠每天每次灌胃0.2 mL，試驗(yàn)持續(xù)28 d。

1.3.2 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，固定小鼠，將其尾部提起，用手指輕輕按壓小鼠下腹部，采集新鮮糞便后置于1.5 mL高壓滅菌離心管中，-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3.3 糞便DNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)

每組分別選取3份糞便樣品，每份準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g置于2 mL離心管中，采用糞便DNA提取試劑盒提取糞便DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度，后將DNA樣品送上海派生諾生物科技股份有限公司測(cè)序分析。

1.3.4 Illumina-MiSeq宏基因組測(cè)序

1.3.4.1 16S rDNA V4區(qū)PCR反應(yīng)

根據(jù)16S rDNA基因的V4區(qū)保守序列設(shè)計(jì)通用引物：上游引物為5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′，下游引物為5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′。為區(qū)分每個(gè)不同的樣本，在通用引物的上游序列前隨機(jī)添加7個(gè)核苷酸堿基的序列標(biāo)簽，即Barcoded-tag，形成Barcoded融合引物。PCR反應(yīng)體系為：Loading Buffer (10×) 2.5 μL，dNTP 2 μL，DNA模板1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA合成酶0.125 μL，ddH2O 17.375 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目標(biāo)條帶用DNA切膠回收試劑盒進(jìn)行回收，得純化樣本，并用BioTek酶標(biāo)儀測(cè)定各樣本濃度并定量。

1.3.4.2 富集并擴(kuò)增DNA文庫(kù)

每個(gè)樣品DNA等量混合，采用標(biāo)準(zhǔn)的Illumina TruSeq DNA文庫(kù)制備試驗(yàn)流程構(gòu)建所需的宏基因組上機(jī)文庫(kù)，并在Illumina-MiSeq個(gè)人基因組分析平臺(tái)上進(jìn)行Barcoded Illumina Miseq測(cè)序，采用PE250測(cè)序策略。試驗(yàn)流程為：通過(guò)3′—5′核酸外切酶及聚合酶的共同作用，修復(fù)帶有突出末端的DNA片段，在修復(fù)平整的DNA片段3′末端引入單堿基A，接頭的3′末端含有單堿基T，從而保證DNA片段和接頭能通過(guò)A和T配對(duì)連接。利用PCR選擇性地富集兩端連有接頭的DNA片段，同時(shí)擴(kuò)增DNA文庫(kù)。

1.3.4.3 驗(yàn)證文庫(kù)、上機(jī)測(cè)序

利用Pico Green和熒光分光光度計(jì)定量文庫(kù)，多樣品DNA文庫(kù)均一化至10 nmol/L后等體積混合，并逐步稀釋定量至4～5 pmol/L后上機(jī)測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

1.4.1 測(cè)序基本數(shù)據(jù)處理

對(duì)經(jīng)過(guò)雙端(pair-end)測(cè)序的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，截?cái)嗷蛏釛壍唾|(zhì)量序列(50個(gè)連續(xù)堿基平均質(zhì)量>Q30，不允許有N)。用軟件Flash連接通過(guò)質(zhì)量控制的序列，舍棄無(wú)法連接的序列。對(duì)選擇通過(guò)的序列進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾原則為：舍棄堿基長(zhǎng)度在200～1 000之外的、含有模糊堿基的、含有錯(cuò)配堿基的、連續(xù)相同堿基>6，模糊堿基>1的序列，獲得最終用于分析的序列。

1.4.2 生物分類(lèi)及統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用Qiime分析軟件，根據(jù)序列的相似度，將序列歸為多個(gè)操作分類(lèi)單元(operational taxonomic unit,OTU)。Qiime調(diào)用Uclust對(duì)序列進(jìn)行聚類(lèi)，選取每個(gè)類(lèi)最長(zhǎng)的序列為代表序列。采用RDP-classifier，以RDP數(shù)據(jù)庫(kù)的序列為訓(xùn)練集，對(duì)OTU代表序列進(jìn)行注釋。

物種豐度按屬層次進(jìn)行歸類(lèi)計(jì)算，先對(duì)物種豐度進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，接著再將轉(zhuǎn)換后的數(shù)值與單樣品豐度平均值之差除以單樣品豐度標(biāo)準(zhǔn)差，完成數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 19，采用方差分析(ANOVA)、t檢驗(yàn)和LSD多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 DON對(duì)小鼠腸道微生物測(cè)序數(shù)據(jù)的影響

表1結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)16S rDNA V4區(qū)的Illumina Miseq雙端測(cè)序，對(duì)照組和DON組分別獲得有效序列86 146.23和84 594.98條，其中優(yōu)質(zhì)序列分別為85 843.64和84 305.31條，DON組較對(duì)照組檢測(cè)序列減少，但統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(P>0.05)。反映97%相似度下樣品取樣深度的稀釋曲線(xiàn)見(jiàn)圖1，每個(gè)樣品均在80 000條左右，表明取樣深度一致。所測(cè)序列長(zhǎng)度集中在178～268 bp之間，平均長(zhǎng)度為226 bp，見(jiàn)圖2。

表1 小鼠糞便樣本測(cè)序數(shù)量分析

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 小鼠腸道微生物豐度分布曲線(xiàn)圖

對(duì)各樣本的OTU豐度大小排序，取log2的對(duì)數(shù)值作豐度分布曲線(xiàn)圖，見(jiàn)圖3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和DON組樣本中物種分布均勻，可用于多樣性分析。

2.3 DON對(duì)小鼠腸道微生物菌群Alpha多樣性的影響

將2組樣品所有序列按97%的相似度進(jìn)行OTU聚類(lèi)，利用程序運(yùn)算得到評(píng)價(jià)微生物Alpha多樣性豐度和均度的Shannon指數(shù)，見(jiàn)圖4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DON組Shannon指數(shù)降低，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。

2.4 DON對(duì)小鼠腸道微生物菌群Beta多樣性的影響

Beta多樣性是不同生態(tài)系統(tǒng)之間多樣性的比較，是物種組成沿環(huán)境梯度或在群落間的變化率，用來(lái)表示生物種類(lèi)對(duì)環(huán)境異質(zhì)性的反應(yīng)。經(jīng)主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)方法分析，見(jiàn)圖5，結(jié)果顯示DON組與對(duì)照組能顯著區(qū)分，并且菌群結(jié)構(gòu)(藍(lán)色)分布緊湊、相似度高，多樣性較對(duì)照組降低。

2.5 物種豐度差異性分析

為探討DON對(duì)腸道微生物群落結(jié)構(gòu)和組成的影響，在門(mén)和屬2個(gè)層次上對(duì)同類(lèi)的OTU進(jìn)行聚類(lèi)比較研究。表2和圖4結(jié)果顯示，在門(mén)水平上，擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)的物種豐度與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)，在總?cè)郝渲械恼急扔?5.01%降低到35.25%；脫鐵桿菌門(mén)(Deferribacteres)的物種豐度與對(duì)照組相比也顯著降低(P<0.05)，占比由0.76%降低到0.39%。軟壁菌門(mén)(Tenericutes)的物種豐度也呈降低趨勢(shì)，與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。變形菌門(mén)(Proteobacteria)的物種豐度與對(duì)照組相比顯著提高(P<0.05)，占比由6.66%提高到8.78%。疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)的物種豐度則呈上升趨勢(shì)，與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。對(duì)照組厚壁菌門(mén)(Firmicutes)在總?cè)郝渲械恼急葹?3.05%，DON組Firmicutes的占比則上升到50.41%，但物種豐度統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(P>0.05)。

C1、C2、C3為對(duì)照組樣本1、2、3；T1、T2、T3為DON組樣本1、2、3。下圖同。

C1, C2 and C3 indicates the sample 1, sample 2 and sample 3 in control group; T1, T2 and T3 indicates the sample 1, sample 2 and sample 3 in DON group. The same as below.

圖1 小鼠糞便樣本測(cè)序序列稀釋曲線(xiàn)(相似度：97%)

Fig.1 Rarefaction curve of sequenced reads in feces of mice (similarity: 97%)

圖2 測(cè)序序列長(zhǎng)度分布

表3結(jié)果顯示，在屬的水平上，與對(duì)照組相比，DON組顯著降低了副類(lèi)桿菌屬(Parabacteroides)、理研菌屬(Rikenella)、Algoriphagus、Mucispirillum、嗜甲基菌屬(Methylophilus)、Francisella的物種豐度(P<0.05)，顯著提高了梭菌屬(Clostridium)、Robinsoniella、Allobaculum、Akkermansia的物種豐度(P<0.05)。同時(shí)，DON組還影響了短桿菌屬(Brevibacterium)、糞球菌屬(Coprococcus)、Kordiimonas、Pusillimonas、厭氧原體屬(Anaeroplasma)的物種豐度，但與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。

圖3 小鼠糞便樣品樣本OTU豐度曲線(xiàn)圖

*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。

* indicates significant difference compared with control groups (P<0.05).

圖4 DON處理后腸道微生物菌群的Shannon指數(shù)變化

Fig.4 Change of Shannon diversity indexes of intestinal microbes exposed to DON

圖5 DON處理后腸道微生物Beta多樣性變化

門(mén)Phylum對(duì)照組ControlgroupDON組DONgroup相對(duì)倍數(shù)變化Relativefoldchange/[log(C/T,2)]P值P-value擬桿菌門(mén)Bacteroidetes33534.20±8510.69a28922.44±1495.53b0.2130.01脫鐵桿菌門(mén)Deferribacteres555.45±46.06a378.73±95.61b0.5530.02變形菌門(mén)Proteobacteria5294.64±587.99b6441.51±841.95a0.2830.01軟壁菌門(mén)Tenericutes234.10±80.28148.46±16.540.6570.07疣微菌門(mén)Verrucomicrobia680.95±35.772472.37±474.48-1.8600.06

C為對(duì)照組，T為DON組。下表同。

C represents the control group, T represents the DON group. The same as below.

此外，圖6呈現(xiàn)了腸道微生物菌群在屬水平的物種間相似性聚類(lèi)關(guān)系(heatmap)，結(jié)果表明DON組小鼠腸道微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，與對(duì)照組相似性差異顯著，與表3結(jié)果一致。

圖7 DON處理后腸道微生物結(jié)構(gòu)區(qū)系圖的變化

屬Genus對(duì)照組ControlgroupDON組DONgroup相對(duì)倍數(shù)變化Relativefoldchange/[log(C/T,2)]P值P-value短桿菌屬Brevibacterium0.63±0.561.25±0.48-0.9760.09副類(lèi)桿菌屬Parabacteroides1806.26±607.93a937.05±281.09b0.9460.03文肯菌屬Rikenella550.72±90.21a323.72±14.15b0.766<0.01Algoriphagus3.90±1.61a1.30±1.08b1.5840.04Mucispirillum555.45±46.06a378.73±95.61b0.5520.03梭菌屬Clostridium0.01±0.00b1.41±0.69a-10.4680.03糞球菌屬Coprococcus0.36±0.140.83±0.09-1.1710.09Robinsoniella121.38±60.49b390.96±230.81a-1.6870.04Allobaculum0.92±1.61b3.01±2.64a-1.0790.04Kordiimonas2.28±1.063.26±1.77-0.5110.08Pusillimonas0.01±0.000.82±0.09-1.2320.08嗜甲基菌屬M(fèi)ethylophilus26.70±8.5618.78±1.720.5070.05Francisella1.01±0.13a0.33±0.00b1.5850.01厭氧原體屬Anaeroplasma233.38±80.52148.22±66.540.6550.09Akkermansia650.57±239.46b2446.55±1277.54a-1.9110.05

3 討 論

動(dòng)物腸道中棲居著大量的微生物菌群，不僅與宿主機(jī)體之間保持著一種動(dòng)態(tài)平衡，不同菌群之間也存在著一定的比例關(guān)系。菌群的穩(wěn)態(tài)對(duì)維持機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)消化吸收、免疫拮抗等生理功能都具有重要的影響[12]。本試驗(yàn)應(yīng)用Illumina-MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，突破傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法和以16S rDNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法，可產(chǎn)生覆蓋廣、深度深的測(cè)序數(shù)據(jù)，并通過(guò)比對(duì)或聚類(lèi)分析，判定微生物群落物種組成的變化，同時(shí)挖掘低豐度或未知的細(xì)菌，能更加全面、準(zhǔn)確地獲得敏感菌群信息，對(duì)準(zhǔn)確判定DON對(duì)腸道微生物毒性作用具有重要意義。

3.1 DON對(duì)腸道菌群多樣性的影響

腸道微生物多樣性是促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、維持機(jī)體免疫和新陳代謝的基礎(chǔ)，多樣性降低極易對(duì)宿主免疫產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響健康[13]。本研究指出，灌胃DON后小鼠腸道微生物測(cè)序數(shù)量2組之間沒(méi)有顯著差異，但DON組的有效序列和優(yōu)質(zhì)序列均較對(duì)照組降低，說(shuō)明腸道微生物的種類(lèi)有所減少。此外，DON組反映Alpha多樣性豐度和均度的Shannon指數(shù)顯著降低，PCoA方法分析Beta多樣性發(fā)現(xiàn)DON組菌群結(jié)構(gòu)分布緊湊，多樣性降低。但Waché等[10]和Piotrowska等[14]的研究表明，飼糧添加DON處理不影響豬腸道菌群的豐度和多樣性，不同的結(jié)果可能是由于檢測(cè)方法、DON添加劑量和動(dòng)物的種屬等差異引起的。課題組前期研究指出灌胃DON后，腸道氨基酸、礦物元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率降低，小鼠體重減輕，免疫機(jī)能下降[15]，推測(cè)與DON致小鼠腸道微生物多樣性降低有關(guān)。

3.2 DON對(duì)腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)和物種豐度的影響

本研究通過(guò)Illumina-MiSeq測(cè)序技術(shù)檢測(cè)小鼠糞便中微生物菌群結(jié)構(gòu)和組成的變化，結(jié)果顯示DON處理后小鼠腸道微生物物種豐度發(fā)生顯著變化，并呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。人類(lèi)腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群分別為Bacteroidetes和Firmicute，在腸道菌群所占的比例約90%以上，小鼠腸道2個(gè)菌門(mén)的占比為85%[16]，本試驗(yàn)中小鼠腸道Bacteroidetes和Firmicutes菌門(mén)占80%以上，DON處理后2個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的總占比沒(méi)有變化，但Bacteroidetes的物種豐度較對(duì)照組顯著降低。Bacteroidetes是一類(lèi)具有促進(jìn)碳水化合物發(fā)酵，參與糖類(lèi)、膽汁酸和類(lèi)固醇代謝等功能的菌群[17]，Wang等[18]給大鼠灌胃黃曲霉毒素B1能顯著抑制腸道中Bacteroidetes相關(guān)菌群豐度，在腸道炎癥或潰瘍時(shí)Bacteroidetes的物種豐度也顯著降低[19]，與本研究結(jié)果一致。此外，Deferribacteres的物種豐度降低，Proteobacteria的物種豐度提高。高脂肪飼糧誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝模型小鼠，Proteobacteria的物種豐度也增加，反映腸黏膜完整性的緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)降低，提示腸道損傷發(fā)生[20]。綜合這些結(jié)果表明DON可能與黃曲霉毒素、高脂飼糧一樣可引起腸道菌群豐度發(fā)生改變，進(jìn)而誘導(dǎo)腸道炎癥，引發(fā)腸道損傷。

在屬的水平，與對(duì)照組相比，DON組顯著降低了Parabacteroides、Rikenella、Algoriphagus、Mucispirillum、Methylophilus、Francisella的物種豐度。多有研究指出，這些菌屬物種豐度的降低與腸道疾病密切相關(guān)。Noor等[21]指出潰瘍性結(jié)腸炎患者比正常人的糞便微生物中Parabacteroides菌屬表達(dá)水平較低，并推測(cè)此菌屬的缺失可能與腸道炎癥有關(guān)。目前腸道中Rikenella的作用還沒(méi)有明確，但有研究指出Rikenellaceae是腸道內(nèi)具有保護(hù)性功能的菌群[22]，本試驗(yàn)Rikenella的物種豐度顯著降低，提示DON有抑制腸道有益菌的作用。Mucispirillum作為腸道細(xì)菌群落標(biāo)志物，在腸炎早期或抗生素應(yīng)用時(shí)豐度顯著降低[23]，與本試驗(yàn)DON使腸道Mucispirillum的物種豐度降低結(jié)果相同。推測(cè)，小鼠灌胃DON可使腸道Parabacteroides和Mucispirillum炎癥敏感菌群以及有益菌Rikenella的物種豐度降低，進(jìn)而引起腸道炎癥發(fā)生，導(dǎo)致腸道損傷同時(shí)危害機(jī)體健康。

此外，DON還降低了腸道中Algoriphagus、Methylophilus和Francisella的物種豐度，由于這些菌屬在腸道中的占比較低，分離培養(yǎng)技術(shù)不成熟，其功能作用研究也鮮有報(bào)道，故有待進(jìn)一步探索研究。

DON灌胃后顯著提高了Clostridium、Robinsoniella、Allobaculum以及Akkermansia的物種豐度，許多研究表明這些菌屬的變化也與腸道感染和炎癥密切相關(guān)。Clostridium是厚壁菌門(mén)的一個(gè)菌屬，包含產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌等多種致病菌，可產(chǎn)生外毒素，對(duì)人和動(dòng)物都有較強(qiáng)的毒害作用。Piotrowska等[14]給豬飼喂DON污染的飼糧發(fā)現(xiàn)結(jié)腸內(nèi)容物中產(chǎn)氣莢膜梭菌含量增加，提示DON可誘導(dǎo)腸道中致病菌含量增加。Robinsoniella被認(rèn)為是臨床腸道感染的繼發(fā)性入侵者，在傷口感染部位或菌血癥患者血液均可分離得到[24]。在白細(xì)胞介素-10(IL-10)基因敲除的腸炎小鼠模型，腸道Robinsoniellapeoriensis的物種豐度也顯著提高[25]，而本研究腸道微生物中Robinsoniella的物種豐度增加，表明DON有誘發(fā)腸道炎癥和感染的可能。Allobaculum盡管在腸道微生物中的占比較低，但有研究指出高膽固醇飼糧誘導(dǎo)的腸炎性小鼠腸道中Allobaculumde的物種豐度增加，并且Allobaculum的物種豐度與抗炎因子的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[26]。Zhou等[27]給小鼠灌胃地溝油后腸道黏膜損傷并誘發(fā)腸炎，Allobaculum豐度也顯著提高，與本研究DON誘導(dǎo)腸道Allobaculum豐度增加結(jié)果一致。Akkermansia是近年來(lái)研究熱門(mén)的一個(gè)菌屬，作為是疣微菌門(mén)的優(yōu)勢(shì)菌群，約占83%，占總腸道微生物的1%～4%[28]，以腸道上皮黏蛋白為碳源和氮源，能削弱腸道黏液屏障的厚度[29-30]。多有研究發(fā)現(xiàn)超重或者肥胖者腸道中Akkermansia的物種豐度降低，推測(cè)腸道中Akkermansia有減緩脂肪沉積，減輕體重的作用[31-32]。楊俊花等[15]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠灌胃DON后，體重顯著降低。此外，Akkermansia還可干擾宿主黏膜平衡而加劇鼠傷寒沙門(mén)氏菌誘發(fā)的腸道炎癥[33]。推斷DON作用使小鼠體重減輕及腸道炎癥發(fā)生，可能與腸道Akkermansia的物種豐度增加有關(guān)。

目前為止，DON致腸道炎癥的報(bào)道較多，主要集中在DON使腸絨毛高度降低、隱窩減少、腸上皮細(xì)胞炎性因子白細(xì)胞介素-12(IL-12)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá)增加等[34-35]。但這些研究均沒(méi)有涉及腸道微生物菌群的變化，DON致腸道菌群豐度變化是否與腸道炎癥有直接的關(guān)系，還有待我們進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，鑒于Parabacteroides和Mucispirillum的物種豐度降低和Clostridium、Robinsoniella、Allobaculum、Akkermansia的物種豐度提高與腸道感染、炎癥的相關(guān)性，故可以將這些菌群豐度的變化作為DON引發(fā)腸道炎癥、危害腸道健康的菌群標(biāo)志物。

4 結(jié) 論

① DON灌胃處理后，小鼠腸道微生物菌群豐度減少，Alpha多樣性和Beta多樣性降低。

② 在門(mén)水平，與對(duì)照組相比，DON組顯著降低了Bacteroidetes和Deferribacteres的物種豐度，顯著提高Proteobacteria的物種豐度。在屬水平，與對(duì)照組相比，DON組顯著降低Parabacteroides、Rikenella、Mucispirillum的物種豐度，顯著提高了Clostridium、Robinsoniella、Allobaculum、Akkermansia的物種豐度。

③ 腸道中這些菌屬豐度的變化與腸道炎癥密切相關(guān)，提示這些菌屬可能是DON引發(fā)腸道炎癥的菌群標(biāo)志物。

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*Corresponding author, professor, E-mail: zhao9912@hotmail.com

(責(zé)任編輯 武海龍)

Effects of Deoxynivalenol on Intestinal Microbiota of Mice Analyzed by Illumina-MiSeq High-Throughput Sequencing Technology

YANG Junhua ZHAO Zhihui*GUO Wenbo GUO Jinli

(InstituteofAgri-FoodStandardsandTestingTechnology,ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai201403,China)

This study was conducted to investigate the effects of deoxynivalenol (DON) on bacterial diversity and species abundance of intestinal microbiota. A total of 40 BALB/c mice weighted about 20 g were randomly allotted to control group (intragastric gavage sterilized saline) and DON group (intragastric gavage 1.8 mg/kg BW DON) with 20 replicates per group and 1 mouse per replicate. The mice were fed by intragastric administration for 28 days. After the test, fresh fecal samples were collected and 3 samples in each group were randomly selected for investigating the microbial community and composition by using Illumina-MiSeq high-throughput sequencing technology. The results showed as follows: 1) the quantities of sequences observed in DON group was less than that in control group (P>0.05). 2) The Alpha and Beta diversity were respectively reduced in DON group, and the Shannon index was also significantly decreased compared with the control group (P<0.05). 3) At the phylum level, compared with the control group, the abundances of Bacteroidetes and Deferribacteres in DON group were significantly decreased (P<0.05), while the abundance of Proteobacteria was significantly increased (P<0.05). At the genus level, compared with the control group, the abundances ofParabacteroides,Rikenella,Algoriphagus,Mucispirillum,MethylophilusandFrancisellain DON group were significantly decreased (P<0.05), but the abundances ofClostridium,Robinsoniella,AllobaculumandAkkermansiain DON group were significantly increased (P<0.05). 4) The cluster analysis showed low similarity of intestinal microflora between the control and DON group. In conclusion, the bacterial diversity and species abundance of intestinal microbiota can be influenced by DON, and it is suggested that the intestinal lesions caused by consumption of DON may be related with the change of intestinal bacteria communities.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(1)：158-167]

high-throughput sequencing; deoxynivalenol; intestinal microbiota

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.01.018

2016-07-21

上海市農(nóng)委科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目[滬農(nóng)科攻字(2013)第3-8號(hào)]；上海市農(nóng)委青年人才成長(zhǎng)計(jì)劃[滬農(nóng)青字(2015)第1-33號(hào)]

楊俊花(1980—)，女，山西清徐人，博士，研究方向?yàn)檎婢舅囟纠韺W(xué)。E-mail: yangjunhua303@126.com

*通信作者：趙志輝，研究員，E-mail: zhao9912@hotmail.com

S811.6

A

1006-267X(2017)01-0158-10