姜 楠 ， 靳 換 ， 李 逸 ， 陳艷紅 ， 周 磊

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 , 北京 海淀 100193)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp11結(jié)構(gòu)與功能

姜 楠 ， 靳 換 ， 李 逸 ， 陳艷紅 ， 周 磊

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 , 北京 海淀 100193)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是一種嚴(yán)重危害生豬養(yǎng)殖的重要病原，以引起感染母豬繁殖障礙和各日齡豬只呼吸道癥狀為特征[1]。PRRSV病原具有免疫抑制、持續(xù)性感染和高度變異的特性，其在靶細(xì)胞(PAMs)中或體內(nèi)的增殖能力能夠直接影響病毒的致病性，而病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp)往往與病毒復(fù)制增殖能力密切相關(guān)[2]。此外，PRRSV所具有的免疫抑制特性也是影響其致病性的重要因素之一。PRRSV感染豬群往往表現(xiàn)出更嚴(yán)重的細(xì)菌繼發(fā)感染，同時(shí)PRRSV感染還可抑制其他疫苗的免疫效果。大量研究表明，PRRSV感染對(duì)先天性免疫反應(yīng)具有明顯的抑制效果，尤其表現(xiàn)出對(duì)I型干擾素通路(IFN)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)，白介素分子(IL)具有下調(diào)作用，而多種病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白參與該類拮抗效應(yīng)[3]。因此，針對(duì)PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)功能的研究以及對(duì)其與宿主相互作用機(jī)制和調(diào)控宿主免疫通路的探索成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，特別是對(duì)PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白nsp11抑制先天性免疫通路、促進(jìn)病毒復(fù)制增殖的分子機(jī)制研究以及其晶體結(jié)構(gòu)的解析已成為重點(diǎn)突破方向，本文將對(duì)PRRSV nsp11研究領(lǐng)域的進(jìn)展做一簡(jiǎn)要綜述。

1 PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白

PRRSV屬于套式病毒目，動(dòng)脈炎病毒科,動(dòng)脈炎病毒屬成員，基因組為單股正鏈RNA， 長(zhǎng)度約為15 kb。含有至少12個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，其中ORF1a編碼病毒復(fù)制酶多聚蛋白pp1a，其自剪切為nsp1α、nsp1β、nsp2-6，nsp7α、nsp7β和nsp8等非結(jié)構(gòu)蛋白，其中通過(guò)-2型核糖體移碼可以形成新的nsp2亞型(nsp2TF)[4]。ORF1b可編碼4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，即nsp9、nsp10、nsp11和nsp12。非結(jié)構(gòu)蛋白具木瓜樣半胱氨酸蛋白酶(nsp1α)、半胱氨酸蛋白酶(nsp2)、3C樣絲氨酸蛋白酶(nsp4)、RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)(nsp9)、解旋酶 (nsp10)和核糖核酸內(nèi)切酶(nsp11)等諸多功能，與病毒的復(fù)制增殖以及宿主的免疫調(diào)控相關(guān)[5]。

2 2Nsp11的酶活性研究

PRRSV nsp11的C′端含有NendoU活性結(jié)構(gòu)域，其與來(lái)自非洲爪蟾的核糖核酸內(nèi)切酶XendoU具有一定的親緣關(guān)系，屬于其家族成員。NendoU具有能夠特異性切割嘧啶堿基的核糖核酸內(nèi)切酶活性，并參與細(xì)胞內(nèi)小核仁RNA的加工。該區(qū)域在套式病毒目中較為保守，早期被認(rèn)為是套式病毒的一個(gè)基因標(biāo)志，目前冠狀病毒和動(dòng)脈炎病毒的NendoU活性區(qū)已被鑒定，且通過(guò)點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該區(qū)域在病毒復(fù)制和致病性中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，但具體機(jī)制尚不明確。NendoU能夠切割RNA底物的3′端嘧啶，產(chǎn)生2′,3′環(huán)核苷酸和5′-OH端，對(duì)尿嘧啶的偏嗜性高于胞嘧啶，同時(shí)對(duì)單鏈RNA(ssRNA)的偏嗜性高于雙鏈RNA(dsRNA)，既對(duì)未配對(duì)嘧啶切割效率高于配對(duì)嘧啶[6-7]。NendoU 核糖核酸內(nèi)切酶與RNA酶A(RNaseA)具有相似的催化機(jī)制，表現(xiàn)為在二者的三級(jí)催化中心兩個(gè)組氨酸(His)和一個(gè)賴氨酸(Lys)具有相似的空間構(gòu)象，同時(shí)二者的切割產(chǎn)物具有一致性[7]。目前有研究表明，金屬離子在套式病毒目各成員的NendoU中發(fā)揮的作用并不相同，較低濃度的Mn2+離子能少量促進(jìn)PRRSV和EAV NendoU的活性，濃度升高后反而抑制，該特性與SARS等冠狀病毒NendoU對(duì)Mn2+離子的依賴性并不相同[7]。

3 nsp11調(diào)控宿主先天性免疫的機(jī)制研究

3.1 nsp11 抑制I型IFN激活通路的研究 早期研究發(fā)現(xiàn)，具有RNase活性的病毒蛋白可通過(guò)降解RNA來(lái)抑制I型IFN的誘導(dǎo)。如瘟病毒屬的BVDV病毒的 Erns蛋白是在病毒膜表面具有RNase活性的糖基化蛋白，可將細(xì)胞外病毒RNA裂解，阻止病毒RNA與IFN激活通路中RNA結(jié)合受體TLR-3的結(jié)合，進(jìn)而阻斷dsRNA介導(dǎo)的IFN信號(hào)通路激活[8]。同理，nsp11 中的 NendoU 具有相似的活性，能夠非特異性地抑制病毒RNA，繼而抑制RNA結(jié)合模式識(shí)別受體如 PKR，RIG-1/MAD5，TLR-3和TLR-7等分子的激活，從而導(dǎo)致IFN激活反應(yīng)的抑制[9]。據(jù)報(bào)道，在nsp11表達(dá)細(xì)胞中，IFN啟動(dòng)子和IRF3報(bào)告基因活性均被顯著抑制，且抑制活性是通過(guò)RIG-I信號(hào)通路介導(dǎo)的。nsp11介導(dǎo)的IFN抑制同樣可以被dsRNA激發(fā)，具有活性的組成型RIG-I和IPS-1，或IRF3作為誘導(dǎo)劑觸發(fā)。隨后的實(shí)驗(yàn)表明，PRRSV nsp11可發(fā)揮阻斷IRF3的作用，抑制IRF3磷酸化，從而阻斷IRF3在細(xì)胞中的入核轉(zhuǎn)移。同時(shí)實(shí)驗(yàn)還證實(shí),nsp11的NendoU活性與IRF3激活的抑制有關(guān)，其活性的催化位點(diǎn)突變(H3735A，H3750A和H3779A)可導(dǎo)致nsp11的IFN抑制功能喪失[10]。除此之外，推測(cè)nsp11還有可能在JAK-STAT信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中或其他干擾素激活途徑中起抑制作用。

3.2 nsp11抑制NF-κB通路的研究 早期研究報(bào)告指出，PRRSV nsp11能夠減少NF-κB啟動(dòng)子的激活[11]，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)肖少波教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究表明，nsp11是一種去泛素化蛋白酶(DUB)，且活性強(qiáng)于PRRSV nsp2蛋白，其對(duì)K48連接形式的泛素化具有去泛素化酶活性，但對(duì)K63連接的多聚泛素?zé)o作用。Nnsp11 可以抑制SEV/poly(I∶C)誘導(dǎo)的β-IFN、NF-κB和IRF3的激活，并呈劑量依賴性。nsp11可通過(guò)去除I κBα上的K48鏈接泛素抑制 NF-κB激活。進(jìn)一步構(gòu)建了nsp11不同位點(diǎn)的突變體，發(fā)現(xiàn)nsp11的D144、K173、D180和Y219 位氨基酸對(duì)DUB活性至關(guān)重要，且DUB活性與其抑制NF-κB呈顯著相關(guān)性，但與其抑制IFN-β的能力不完全吻合，說(shuō)明抑制IFN可能是其核酸內(nèi)切酶活性與DUB活性的一種綜合效應(yīng)[12]。

3.3 nsp11抑制IL-1β分泌的研究 據(jù)河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院張改平院士團(tuán)隊(duì)報(bào)道，在體外感染實(shí)驗(yàn)中， PRRSV感染早期能夠通過(guò)NLRP3炎性體通路激活PAM靶細(xì)胞IL-1β的表達(dá)和分泌，但在感染后期，pro-IL-1β mRNA 和 IL-1β蛋白的表達(dá)水平開(kāi)始降低，并降至mock感染組的水平，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PRRSV nsp11蛋白的表達(dá)能夠抑制由LPS誘導(dǎo)的pro-IL-1β mRNA的轉(zhuǎn)錄和IL-1β蛋白的分泌[13]。

3.4 nsp11 抑制TNF-α轉(zhuǎn)錄表達(dá)的研究 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)楊漢春教授團(tuán)隊(duì)用熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)證實(shí)，PRRSV的nsp7、nsp11和nsp12是不同致病性PRRSV毒株誘導(dǎo)TNF-α的mRNA差異表達(dá)的病毒蛋白。通過(guò)分析各個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)ERK信號(hào)通路的影響，發(fā)現(xiàn)高致病性PRRSV毒株的nsp1β和nsp11能抑制ERK信號(hào)通路，進(jìn)而抑制TNF-α蛋白產(chǎn)生。運(yùn)用反向遺傳技術(shù)同時(shí)置換高低致病性毒株間nsp1β和nsp11的拯救毒能反轉(zhuǎn)TNF-α蛋白差異表達(dá)的現(xiàn)象，證實(shí)nsp1β和nsp11在不同致病性PRRSV毒株誘導(dǎo)的TNF-α差異表達(dá)中發(fā)揮重要作用。其結(jié)果表明，HP-PRRSV通過(guò)其nsp11與nsp1β可有效抑制TNF-α產(chǎn)生，從而有利于其在宿主體內(nèi)的復(fù)制，這可能是導(dǎo)致其致病性和毒力增強(qiáng)的機(jī)制之一[14]。

3.5 nsp11抑制RNA干擾相關(guān)分子的研究 PRRSV感染能夠通過(guò)下調(diào)RNA沉默通路中的重要分子argonaute protein-2 (Ago-2)的表達(dá)來(lái)抑制感染細(xì)胞內(nèi)由short-hairpin (sh) RNA, double-strand (ds) RNA 和 microRNA (miRNA)引起的RNA沉默效應(yīng)。同時(shí)如果使用siRNA 和shRNA下調(diào)MARC-145和PAM細(xì)胞中的RNA 沉默相關(guān)分子Dicer和Ago-2 能夠反過(guò)來(lái)上調(diào)PRRSV感染的病毒滴度。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV的nsp11以及nsp1α的表達(dá)能夠抑制Ago-2的表達(dá)水平從而抑制細(xì)胞內(nèi)RNA 沉默效應(yīng)，這也是PRRSV與宿主協(xié)調(diào)進(jìn)化的結(jié)果，使得病毒能夠突破宿主細(xì)胞的限制，創(chuàng)造一個(gè)適宜病毒增殖的細(xì)胞環(huán)境[15]。

4 nsp11的結(jié)構(gòu)生物學(xué)特點(diǎn)

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的彭貴青教授團(tuán)隊(duì)在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)了PRRSV nsp11蛋白,通過(guò)晶體生長(zhǎng)條件篩選，獲得較高衍射率的晶體(2.6A)，并首次成功解析動(dòng)脈炎病毒的NendoU結(jié)構(gòu)，證實(shí)nsp11 為一個(gè)奇特的與冠狀病毒核糖核酸內(nèi)切酶nsp15存在顯著區(qū)別的不對(duì)稱二聚體結(jié)構(gòu)，單體由17個(gè)β折疊和3個(gè)α螺旋組成，第74位絲氨酸以及76位苯丙氨酸對(duì)于二聚體的形成至關(guān)重要。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn),PRRSV nsp11二聚體形成的關(guān)鍵氨基酸對(duì)于核酸內(nèi)切酶活性至關(guān)重要，生化及結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)也表明了穩(wěn)定的二聚體結(jié)構(gòu)是nsp11發(fā)揮NendoU功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。此外，晶體結(jié)構(gòu)證實(shí)了動(dòng)脈炎病毒和冠狀病毒的核糖核酸內(nèi)切酶關(guān)鍵的催化表位具有很高的結(jié)構(gòu)保守性，從結(jié)構(gòu)生物學(xué)的角度解析了為何兩者具有相似的RNA底物切割機(jī)制[15]。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，PRRSV nsp11 含有NendoU結(jié)構(gòu)功能域，具有RNaseA相似的核酸內(nèi)切酶活性，其在套式病毒目中高度保守，且與病毒復(fù)制息息相關(guān)，但其詳細(xì)機(jī)制并不清楚。NendoU可通過(guò)其核酸內(nèi)切酶活性，抑制dsRNA相關(guān)的模式識(shí)別分子激活通路，同時(shí)還可通過(guò)DUB活性抑制NF-κB通路的激活，從而抑制I型IFN的激活，創(chuàng)造利于病毒增殖的細(xì)胞環(huán)境。除以上研究所報(bào)道過(guò)的功能以外，nsp11是否還具有其他的生物學(xué)功能？當(dāng)前，通過(guò)篩選和鑒定與nsp11相互作用的宿主細(xì)胞蛋白來(lái)間接揭示nsp11的靶向分子，進(jìn)一步探究nsp11的生物學(xué)功能是一個(gè)重要切入點(diǎn)，可以為理解病毒的復(fù)制和致病機(jī)制奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

[1] Christianson W T, Choi C S, Collins J E,etal. Pathogenesis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in mid-gestation sows and fetuses [J]. Can J Vet Res, 1993, 57(4):262-268.

[2] Han J, Zhou L, Ge X,etal. Pathogenesis and control of the Chinese highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus [J]. Veterinary Microbiology, 0378-1 135, 2 017.

[3] Fang Y and Snijder E J. The PRRSV replicase: exploring the multifunctionality of an intriguing set of nonstructural proteins [J]. Virus Res, 2010, 154(1-2):61-76.

[4] Fang Y, Treffers E E, Li Y,etal. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012, 109(43):E2 920-2 928.

[5] Snijder E J, Kikkert M, and Fang Y. Arterivirus molecular biology and pathogenesis [J]. J Gen Virol, 2013, 94(Pt 10):2 141-2 163.

[6] Bhardwaj K, Sun J, Holzenburg A,etal. RNA recognition and cleavage by the SARS coronavirus endoribonuclease [J]. J Mol Biol, 2006， 361(2):243-256.

[7] Nedialkova D D, Ulferts R, Van Den Born E,etal.Biochemical characterization of arterivirus nonstructural protein 11 reveals the nidovirus-wide conservation of a replicative endoribonuclease [J]. J Virol, 2009， 83(11):5 671-5 682.

[8] Magkouras I, Matzener P, Rumenapf T,etal. RNase-dependent inhibition of extracellular, but not intracellular, dsRNA-induced interferon synthesis by Erns of pestiviruses [J]. J Gen Virol, 2008， 89(Pt 10):2 501-2 506.

[9] Yoo D, Song C, Sun Y,etal.Modulation of host cell responses and evasion strategies for porcine reproductive and respiratory syndrome virus [J]. Virus Res, 2010， 154(1-2):48-60.

[10] Shi X, Wang L, Li X,etal. Endoribonuclease activities of porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp11 was essential for nsp11 to inhibit IFN-beta induction [J]. Mol Immunol, 2011， 48(12-13):1 568-1 572.

[11] Beura L K, Sarkar S N, Kwon B,etal.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus nonstructural protein 1beta modulates host innate immune response by antagonizing IRF3 activation [J]. J Virol, 2010， 84(3):1 574-1 584.

[12] Wang D, Fan J, Fang L,etal.The nonstructural protein 11 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus inhibits NF-kappaB signaling by means of its deubiquitinating activity [J].Mol Immunol, 2015， 68(2 Pt A):357-366.

[13] Wang C, Shi X, Zhang X,etal.The Endoribonuclease Activity Essential for the Nonstructural Protein 11 of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus to Inhibit NLRP3 Inflammasome-Mediated IL-1beta Induction [J]. DNA Cell Biol, 2015， 34(12):728-735.

[14] He Q, Li Y, Zhou L,etal. Both Nsp1beta and Nsp11 are responsible for differential TNF-alpha production induced by porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains with different pathogenicity in vitro [J]. Virus Res, 2015， 201:32-40.

[15] Shi Y, Li Y, Lei Y,etal. A Dimerization-Dependent Mechanism Drives the Endoribonuclease Function of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus nsp11 [J]. J Virol, 2016， 90(9):4 579-4 592.

A

0529-6005(2017)08-0059-03

2017-06-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31302088)

姜楠(1994-)，女，本科生，就讀于動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)，E-mail：jiangnan314@126.com

陳艷紅，E-mail：chenyh@cau.edu.cn；周磊，E-mail: leosj@cau.edu.cn