付旭鋒，陳冰冰，嚴(yán)亞萍，王宏，王峻峰，鄭冰蓉，司維*

(1. 昆明理工大學(xué)靈長(zhǎng)類轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，昆明 650500；2. 云南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，昆明 650091；3. 云南中科靈長(zhǎng)類生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；4. 云南省第一人民醫(yī)院肝膽外科，昆明理工大學(xué)附屬昆華醫(yī)院， 昆明 650032)

研究進(jìn)展

動(dòng)物模型在間充質(zhì)干細(xì)胞治療慢性肝病臨床前研究的應(yīng)用

付旭鋒1,2，陳冰冰1,3，嚴(yán)亞萍1,3，王宏1,3，王峻峰4，鄭冰蓉2*，司維1,3*

(1. 昆明理工大學(xué)靈長(zhǎng)類轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，昆明 650500；2. 云南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，昆明 650091；3. 云南中科靈長(zhǎng)類生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；4. 云南省第一人民醫(yī)院肝膽外科，昆明理工大學(xué)附屬昆華醫(yī)院， 昆明 650032)

慢性肝病進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化并導(dǎo)致肝硬化，此時(shí)除了器官移植外沒有更為有效的治療方法。然而器官缺乏的問題迫使人們尋找更為有效的治療策略。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)有著免疫調(diào)節(jié)、分化成肝細(xì)胞、促進(jìn)原位肝細(xì)胞再生和抑制肝星狀細(xì)胞的激活等能力，所以利用MSCs開展細(xì)胞移植治療具有非常廣闊的前景。本文通過綜述各類人的肝病動(dòng)物模型和運(yùn)用這些動(dòng)物模型開展MSCs細(xì)胞移植治療肝病的臨床前研究的進(jìn)展和意義，將為今后在MSCs開展臨床治療的廣泛應(yīng)用中提供安全性和有效性評(píng)價(jià)的科學(xué)依據(jù)。

肝病動(dòng)物模型；間充質(zhì)干細(xì)胞；臨床前研究

慢性肝病是由于肝損傷因素如病毒、自身免疫、膽汁阻塞、有毒物、代謝疾病等引起肝臟慢性損傷[1]。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示目前全世界有肝炎病毒感染的數(shù)目達(dá)5.5億人并且每年大約有40萬(wàn)人死于病毒性肝病[2]。在中國(guó)，肝炎病毒的感染人口約占10%，其中乙型肝炎達(dá)7.2%[3]。世界上肝病死亡的人口中約有3.8%是由飲酒引起的酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)所導(dǎo)致，并且有近30%的人患有非酒精脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)[4]。

雖然肝移植是治療終末端肝病的有效方法，然而由于可供移植肝源非常緊缺，加上手術(shù)并發(fā)癥、免疫排斥以及高昂的醫(yī)療費(fèi)用等問題限制了這一治療方法的應(yīng)用。近年來，再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域干細(xì)胞的發(fā)展為解決臨床醫(yī)學(xué)問題提供了廣闊的應(yīng)用前景。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有自我更新和分化為三胚層多種細(xì)胞的能力，具有容易獲取和沒有倫理問題的特點(diǎn)，使得其更適合應(yīng)用于臨床治療[5]。目前，MSCs治療肝硬化已經(jīng)開展了初步的人體臨床試驗(yàn)。然而，臨床試驗(yàn)結(jié)果卻存在矛盾：部分隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)研究結(jié)果顯示了患者的肝功能通過移植骨髓MSCs得到了明顯改善[6]。與此相反，另外一些臨床試驗(yàn)在移植MSCs后并未改善肝硬化病人的肝功能[7]。由于多數(shù)臨床試驗(yàn)缺乏合理的隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因此難以對(duì)MSCs移植治療肝病的有效性做出準(zhǔn)確的結(jié)論[8]。除此之外，有研究發(fā)現(xiàn)人源的骨髓MSCs在小鼠體內(nèi)可以分化為成肌纖維細(xì)胞的形態(tài)[9]。另外，MSCs在體內(nèi)是促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)還是抑制腫瘤的生長(zhǎng)也存在爭(zhēng)議[10]。因此，將MSCs作為肝病治療的一種“藥品”真正進(jìn)入臨床應(yīng)用之前，必須制定嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，通過比照其他常規(guī)藥物進(jìn)行MSCs細(xì)胞移植治療的有效性和安全性進(jìn)行評(píng)估[11]。開展安全性和有效性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵是建立能夠模擬人類肝病的合適動(dòng)物模型。然而，長(zhǎng)期以來缺乏合適的并能真實(shí)重現(xiàn)人類肝病病理和代謝特征的動(dòng)物模型，嚴(yán)重制約了肝病藥物和治療手段開發(fā)[12]。

1 人肝病動(dòng)物模型

1.1 酒精性肝病模型

酒精性肝病(ALD)是由于長(zhǎng)期過量飲酒導(dǎo)致的酒精性肝病。在肝臟中，乙醇在乙醇脫氫酶的作用下形成乙醛，并進(jìn)一步為線粒體內(nèi)的乙醛脫氫酶所催化而轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜帷Ｔ撗趸^程會(huì)抑制線粒體的三羧酸循環(huán)和脂肪酸β氧化。同時(shí)，長(zhǎng)期的肝損傷和持續(xù)的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，從而激活免疫反應(yīng)導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)激活和膠原沉積[13]。利用酒精造模的優(yōu)點(diǎn)是效率高、操作簡(jiǎn)便且價(jià)格低廉，建立的動(dòng)物模型相對(duì)穩(wěn)定。但缺點(diǎn)是自由飲用不能保證個(gè)體的飲用量，若用灌胃的方法易引起急性胃擴(kuò)張和酒精誤入氣管致動(dòng)物死亡。

1.2 非酒精脂肪肝(NAFLD)模型

目前認(rèn)為最便捷的建立NAFLD模型是通過喂食一些高能量并含不同脂類(飽和脂肪、不飽和脂肪、反式脂肪酸和膽固醇)的飼料[14]。用含膽固醇和膽堿的動(dòng)脈粥樣硬化的飼料持續(xù)喂養(yǎng)大鼠和小鼠都會(huì)引起肝臟細(xì)胞脂肪變性、脂肪性肝炎和細(xì)胞外的纖維化[15]。蛋氨酸和膽堿缺陷型飼料(methionine- and choline-deficient diet，MCDD)也是誘導(dǎo)建立NAFLD模型的一種常見飼料。蛋氨酸和膽堿是形成磷脂酰膽堿的主要原料，主要負(fù)責(zé)肝臟中分泌極低密度脂蛋白，蛋氨酸和膽堿的缺乏必然會(huì)導(dǎo)致極低密度脂蛋白的積累[15]。常用的基因修飾的脂肪性肝炎和纖維化的模型有核固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(nuclear sterol regulatory element-binding protein 1c，nSREBP-1c)轉(zhuǎn)基因小鼠和同源性磷酸酶—張力蛋白(phosphatase and tensin homolog，PTEN)的敲除小鼠，這兩種小鼠能夠在20周后出現(xiàn)肝細(xì)胞外周纖維化。另外，膽總管結(jié)扎(common bile duct ligation，CBDL)也是一種建立動(dòng)物模型的方法，膽汁流動(dòng)的中斷會(huì)引起強(qiáng)烈的管裝增殖反應(yīng)、門脈炎癥和門脈纖維化的形成[16]。也有研究用自身免疫的方法誘導(dǎo)產(chǎn)生肝纖維模型，然而這種方法的困難主要在于破壞其免疫耐受性和改變慢性肝炎到肝纖維化過程的免疫性[17]。

1.3 肝毒性的肝纖維模型

四氯化碳(CCl4)，硫代乙酰胺(TAA)，二甲基亞硝胺(DMN)，二乙基亞硝胺(DEN)是常用的誘導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物毒性化學(xué)品，主要是改變肝小葉中心的肝細(xì)胞的新陳代謝而引起損傷。CCl4通過Cyt-450 途徑被分解為CCl3-自由基后可與肝細(xì)胞中的大分子產(chǎn)生共價(jià)結(jié)合，引起脂質(zhì)過氧化同時(shí)產(chǎn)生ROS，進(jìn)而引起肝細(xì)胞由合成Ⅲ型膠原的途徑改為合成I型膠原，從而導(dǎo)致肝纖維化的產(chǎn)生[18]。該模型的肝纖維化進(jìn)展穩(wěn)定，與人慢性肝病導(dǎo)致的肝纖維化發(fā)展為肝硬化相似，具有操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短(約8周)和成功率高(達(dá)到80%)的特點(diǎn)。連續(xù)的腹腔注射硫代乙酰胺(TAA)會(huì)導(dǎo)致大鼠在12周出現(xiàn)嚴(yán)重的纖維化并且在16周出現(xiàn)肝硬化，而小鼠分別在16周和24周出現(xiàn)[19]。同樣，DMN和DEN也可以在肝纖維的情況下緩慢誘導(dǎo)成肝癌[20, 21]。

1.4 病毒性肝病模型

目前病毒性肝炎已經(jīng)在疫苗的研發(fā)和治療上取得了一些進(jìn)展，但有效的疫苗和藥物的研究仍處于起步階段。甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)已在很多動(dòng)物上有過試驗(yàn)，但是由于人的肝炎病毒的宿主范圍非常狹窄，而且人的肝炎病毒都不能有效的感染嚙齒類動(dòng)物，所以這類疫苗的研發(fā)起初都使用了黑猩猩，但是由于成本和倫理道德等原因被限制。近年來，人們也在試圖使用一些基因編輯的小型動(dòng)物取代部分非人靈長(zhǎng)類作為肝炎病毒的動(dòng)物模型，在發(fā)病機(jī)理、疫苗和治療性藥物的研究取得了一定進(jìn)展。

1.5 肝病模型動(dòng)物的比較

理想的肝病模型不僅應(yīng)在病理特征相似，還應(yīng)出現(xiàn)明顯的發(fā)展的階段性的過程，并且要有形成率高、死亡率低、重復(fù)性好、方法簡(jiǎn)便、動(dòng)物易獲得和經(jīng)濟(jì)實(shí)用的特點(diǎn)。嚙齒動(dòng)物作為建立動(dòng)物模型的主要材料，有著來源充足、飼養(yǎng)費(fèi)用低廉和易于批量的飼養(yǎng)等特點(diǎn)，然而嚙齒類動(dòng)物與人類的基因組學(xué)有著較大差異，不能夠真正反映人類的疾病特征[22]。針對(duì)嚙齒動(dòng)物不能真正反映人類肝病的問題，科學(xué)家們努力找到了在進(jìn)化上較嚙齒類更接近人的樹鼩，并且在肝炎病毒和NAFLD的研究中取得一定進(jìn)展。然而，樹鼩的生長(zhǎng)周期不能更好的模擬人類由于長(zhǎng)期導(dǎo)致的肝病的發(fā)展過程。只有和人類有高度相似性的肝病動(dòng)物模型才能解決人類疾病基礎(chǔ)研究問題，為此人類將目標(biāo)轉(zhuǎn)向了非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物。有報(bào)道通過長(zhǎng)期對(duì)獼猴喂食酒精產(chǎn)生了與人病理特征相似的脂肪肝后研究了對(duì)基因表達(dá)的影響，克服了長(zhǎng)期生活習(xí)慣造成的肝病發(fā)展過程的難題[23]。雖然非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物具有建立肝病的良好優(yōu)勢(shì)，但是也要考慮飼養(yǎng)成本和道德方面的問題。

2 MSCs用于慢性肝病治療的臨床研究的意義與存在的問題

目前，對(duì)肝病的晚期如肝硬化和肝癌的最有效治療當(dāng)然是肝移植，然而供體器官的缺乏、手術(shù)并發(fā)癥、免疫排斥和高昂的費(fèi)用都是限制器官移植的重要因素。近年來，研究發(fā)現(xiàn)MSCs有著干細(xì)胞自我更新的特性和和分化多種類型細(xì)胞的潛能，被認(rèn)為是組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最具前景的細(xì)胞之一。MSCs是一類成體結(jié)締組織干細(xì)胞，可從中胚層和外胚層組織中分離得到[24]。MSCs沒有特異的標(biāo)簽分子，但是對(duì)塑料的培養(yǎng)皿表面有很強(qiáng)的吸附能力，表達(dá)CD73、 CD90、CD105、CD44等分子，不表達(dá)CD34、 CD45、CD14 和 HLA-DR等分子。MSCs有著在特異的誘導(dǎo)培養(yǎng)基下分化成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞的能力[25]。所以，MSCs的鑒定主要根據(jù)形態(tài)、表面分子和三系分化能力的特性來鑒定。

2.1 MSCs治療的優(yōu)勢(shì)

MSCs被認(rèn)為具有治療肝病的能力主要是因?yàn)橛小皻w巢”和定植在損傷位點(diǎn)的能力、分化成肝細(xì)胞樣細(xì)胞、改變損傷部位的微環(huán)境等特性。在組織的損傷位點(diǎn)會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)的趨化因子，表面表達(dá)SDF-1受體CXCR4的MSCs可以被SDF-1招募至損傷位點(diǎn)而發(fā)揮作用[26]。另外，MSCs還有著低表達(dá)人類白細(xì)胞抗原I型分子，不表達(dá)免疫原性的相關(guān)分子如主要組織相容性復(fù)合物II型抗原、CD40和CD40L等分子的特性[27]。有研究將MSCs和HSCs共培養(yǎng)后明顯抑制了肝星狀細(xì)胞(HSCs)增殖和α-平滑肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)，同時(shí)也增加了超氧化物歧化酶(SOD)的活性和相關(guān)的抗氧化分子。另外，MSCs和肝細(xì)胞共培養(yǎng)或誘導(dǎo)培養(yǎng)基的條件下都能分化成肝樣細(xì)胞[28, 29]。

2.2 臨床試驗(yàn)

MSCs的移植有靜脈注射、腹腔注射、肝內(nèi)注射、脾內(nèi)注射和門靜脈注射等多種途徑，同時(shí)在肝病的臨床試驗(yàn)階段也取得了顯著成效[30]。

2.3 存在風(fēng)險(xiǎn)問題

雖然MSCs已被廣泛用于臨床和臨床前研究，但是存在的一些問題必須考慮，包括纖維細(xì)胞的形成、促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、導(dǎo)致腫瘤性和能否在體內(nèi)持久有效等。有報(bào)道稱輸注 MSCs后分化成肌成纖維細(xì)胞而不是肝細(xì)胞，并且認(rèn)為MSCs能夠分泌的各種生長(zhǎng)因子會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)和心血管形成[31]。雖然還沒有MSCs在臨床試驗(yàn)中發(fā)生惡變的報(bào)道，但在移植前的MSCs體外擴(kuò)大培養(yǎng)過程中發(fā)生的基因突變的風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。盡管MSCs已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中取得了一定成效，但是報(bào)道的這些風(fēng)險(xiǎn)也應(yīng)引起足夠的重視。完善MSCs的臨床前安全性和有效性的評(píng)價(jià)，是未來MSCs用于臨床治療的關(guān)鍵和前提。

3 利用人類肝病動(dòng)物模型開展MSCs治療的臨床前研究的意義

3.1 MSCs的臨床前研究目標(biāo)

目前，MSCs在臨床上治療肝病還沒有完整的治療體系和標(biāo)準(zhǔn)，而整個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的建立和完善都需要先在動(dòng)物模型上完成臨床前的評(píng)價(jià)。MSCs的治療在臨床的復(fù)雜程度遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)室的研究，包括患者的的年齡、患病時(shí)間、用藥史和其他疾病引起的并發(fā)癥等因素都制約著治療效果。另外，臨床上MSCs移植的安全性和有效性一直成為科學(xué)家們爭(zhēng)議的話題，針對(duì)移植后是否會(huì)致瘤、定植和分化等問題的都需要在臨床前完成后才能應(yīng)用于臨床。所以說MSCs的臨床前的研究目標(biāo)其一是建立和完善MSCs治療肝病的體系和標(biāo)準(zhǔn)；其二是評(píng)價(jià)MSCs治療肝病的安全性和有效性。

3.2 動(dòng)物模型在MSCs治療肝病的臨床前應(yīng)用前景

雖然MSCs已被很多人認(rèn)為是治療肝病的“良藥”，但是由于安全性和有效性的爭(zhēng)議使之評(píng)價(jià)需在動(dòng)物模型上完成。目前，還沒有一種動(dòng)物能夠完全展示人的肝病病理發(fā)展歷程，包括從脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化到肝癌或急性肝損傷的完整過程。另外，引起人的各類肝病的因素非常復(fù)雜，有遺傳、病毒、用藥史和生活習(xí)慣等，這些都是限制建立能真正模擬人類肝病模型的主要因素，所以在動(dòng)物模型的設(shè)計(jì)上，研究者們嘗試通過選擇相同性別、年齡和同種品系的健康動(dòng)物盡可能控制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生理?xiàng)l件。針對(duì)MSCs在臨床移植后是否會(huì)致瘤、定植和分化等安全和有效性的問題只能通過檢測(cè)患者的生活是否改善來評(píng)價(jià)，所以會(huì)選擇與人有相似病理特征的動(dòng)物模型上進(jìn)行。另外，由于MSCs在臨床試驗(yàn)中的治療效果還沒有達(dá)到最佳，仍然需要在動(dòng)物模型上優(yōu)化和完善整個(gè)治療體系和標(biāo)準(zhǔn)。

嚙齒類動(dòng)物有著便宜、繁殖快和易改造基因的特點(diǎn)，被認(rèn)為是MSCs研究的良好哺乳動(dòng)物。目前現(xiàn)有的MSCs治療肝病動(dòng)物模型主要都集中在用自體或異體的MSCs治療CCl4誘導(dǎo)的嚙齒類動(dòng)物模型。Jung 等[32]人通過尾靜脈向CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維模型移植了1×106個(gè)人臍帶血的MSCs，發(fā)現(xiàn)4周后分化成了肝樣細(xì)胞。Nasir[33]和Li等[34]分別通過肝內(nèi)和尾靜脈向CCl4誘導(dǎo)的小鼠纖維模型輸注了同種異體的骨髓MSCs后發(fā)現(xiàn)明顯降低了肝纖維化和改善了肝功能。雖然目前的MSCs的臨床前研究還集中在嚙齒動(dòng)物上，但對(duì)嚙齒動(dòng)物預(yù)測(cè)MSCs治療的安全性和有效性仍然存在爭(zhēng)議，主要是因?yàn)榻⒌男∈竽Ｐ团c人的病理特征差別較大使得科學(xué)家們尋找更適合的動(dòng)物模型[35]。由于非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物在組織學(xué)、生物代謝和免疫學(xué)方面要比其他動(dòng)物與人有更高的相似性，所以以非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物建立動(dòng)物模型能夠更好的模擬出人的疾病特征以便更有效地研究MSCs的有效性。所以，建立與人類疾病有高度相似性的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型(如利用基因編輯技術(shù)建立的動(dòng)物模型)在MSCs治療肝病的臨床前研究有著至關(guān)重要的作用，將有助于更好地認(rèn)識(shí)人類肝病發(fā)生及發(fā)展規(guī)律和治療，在MSCs治療人類肝病的生物醫(yī)學(xué)研究中有廣闊的前景。

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A review on the application of animal models in preclinical research of the treatment of liver diseases with mesenchymal stem cells

FU Xu-feng1,2, CHEN Bing-bing1,3, YAN Ya-ping1,3, WANG Hong1,3, WANG Jun-feng4, ZHENG Bing-rong2*, SI Wei1,3*,

(1. Institute of Primate Translational Medicine, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China; 2. School of Medicine, Yunnan University, Kunming 650091; 3. Yunnan Key Laboratory of Primate Biomedical Research, Kunming 650500; 4. Department of Hepatic and Biliary Surgery, First people’s Hospital of Yunnan Province， Kunhua Hospital Affiliated to Kunming University of Science and Technology, Kunming 650032.)

Chronic liver diseases can further develop to liver fibrosis and cirrhosis. Currently, there is no effective treatment except liver orthotopic transplantation at this point. The extreme shortage of liver organ source forced people to find alternative treatment strategies. Mesenchymal stem cells (MSCs) have the abilities of immunomodulatory, hepatocyte differentiation, promotion of liver cells regeneration in situ and inhibiting the activation of hepatic stellate cells. Therefore, MSCs transplantation provides a very broad prospect for cell therapy. It is important to provide preclinical evaluation of the efficacy and safety before the application of cell therapy in clinical trials. The progress of various animal models of human liver diseasees and significance of using MSCs to treat liver diseases in preclincal studies based on these animal models were reviewed in this paper.

Liver disease, animal models; Mesenchymal stem cells, MSCs; Preclincal study

ZHENG Bing-rong, E-mail: zhengbr@ynu.edu.cn； SI Wei Email： siwei76@hotmail.com

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFA0101400);國(guó)家重大科學(xué)研究計(jì)劃重大科學(xué)問題目標(biāo)導(dǎo)向項(xiàng)目(2012CBA01305)；云南省中青年學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人后備人才及云南省技術(shù)創(chuàng)新人才(2012HB040)。

付旭鋒(1988-)，男，博士，主要從事干細(xì)胞應(yīng)用基礎(chǔ)研究。Email： fuxufeng100@163.com

鄭冰蓉，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事人類分子遺傳學(xué)研究。Email： zhengbr@ynu.edu.cn；司維，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事干細(xì)胞應(yīng)用研究。Email： siwei76@hotmail.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 01-0102-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.01.019

2016-06-29