張樹山，張德福，戴建軍，吳彩鳳

（上海農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106）

家畜精子耐凍性機制研究進展

張樹山，張德福*，戴建軍，吳彩鳳

（上海農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106）

精子耐凍性的個體間差異性在不同家畜均普遍存在，制約著家畜精液冷凍保存技術(shù)的進一步發(fā)展。本文系統(tǒng)綜述了近年來家畜精子耐凍性機制研究進展，以期為揭示家畜精子耐凍性機制提供參考。

家畜；精子；耐凍性

精液冷凍保存技術(shù)在家畜新品種培育方面具有重大意義，可使人工授精不受時空限制，更大程度地提高優(yōu)良種公畜遺傳資源的利用效率，但家畜精子耐凍性均存在不同程度的個體間差異，大大限制了精液冷凍保存技術(shù)在部分耐凍性較差的種畜群體中的應用。早期研究認為，在家畜精液預處理降溫過程中，不同家畜個體精子對“低溫打擊”敏感度存在明顯差異，這可能是造成公畜精子耐凍性不同的直接原因[1]。推測原因可能是不同種屬或品種的精子質(zhì)膜組成成分存在較大差異，然而確切的精子耐凍性影響機制仍不清楚。近十幾年來，隨著蛋白質(zhì)組學和轉(zhuǎn)錄組學等研究手段在動物精子上應用日益成熟，使得從系統(tǒng)生物學的思路探索精子耐凍性影響機制成為可能，并取得了一些進展。本文對家畜精子耐凍性機制的相關(guān)研究方法及進展進行了綜述，以期為揭示其影響機制及推動家畜精液冷凍保存技術(shù)發(fā)展提供借鑒。

1 人類及動物精子機理性研究的主要方法

早期在DNA水平研究發(fā)現(xiàn)，生理功能異常的精子很少有基因序列發(fā)生改變，而其生理功能異?？赡苁寝D(zhuǎn)錄或翻譯過程中造成的，故在DNA水平探索精子相關(guān)機制存在較大局限性[2]。蛋白質(zhì)是細胞增殖、分化、衰老和凋亡等重大生命活動的執(zhí)行者，生理功能的產(chǎn)生以及病理性變化往往由蛋白質(zhì)群體甚至整體共同完成。RNA是DNA和蛋白質(zhì)之間進行遺傳信息傳遞不可少的“媒介”，RNA和DNA在生命的進程中均扮演著重要的角色。近幾年來，蛋白質(zhì)和RNA微量提取、相關(guān)定性與定量的高通量檢測等技術(shù)相繼問世以及生物信息學飛速發(fā)展，使得在蛋白質(zhì)和RNA水平對精子通過比較分析研究探索其生理功能異常成為可能。目前，高通量的蛋白質(zhì)組學和轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)已廣泛用于人類及家畜精子研究領(lǐng)域。

1.1 蛋白質(zhì)水平 自蛋白質(zhì)組學研究手段問世以來，研究者就開始將其應用于男性不育及動物繁殖研究。除精子外，精漿作為精子的天然培養(yǎng)基，其中的精漿蛋白也是重要研究對象。對動物精子蛋白和精漿蛋白通常采用比較蛋白質(zhì)組學的研究思路，即通過對精子/精漿蛋白在不同空間、不同時間上動態(tài)變化著的蛋白質(zhì)組進行比較，分析不同蛋白質(zhì)組之間的蛋白質(zhì)在表達數(shù)量、表達水平和修飾狀態(tài)上的差異。雙向電泳（Two-dimensional Electrophoresis，2-DE）對極酸或極堿蛋白、分子量極大（大于200 ku）或極?。ㄐ∮?0 ku）蛋白及難溶蛋白的分離存在局限性，且操作稍繁瑣、重復性差等。目前，iTRAQ等新的高通量、精準的蛋白質(zhì)定性與定量技術(shù)已逐步取代2-DE-質(zhì)譜體系，成為蛋白質(zhì)組學研究的普遍手段。

迄今為止，比較蛋白質(zhì)組學已廣泛地應用在人類[3]和幾乎所有家畜[4]精子研究中，在探索男性不育機制及尋找一些家畜精子生理功能相關(guān)標記蛋白等方面取得了較大突破，建立了較成熟的針對精子/精漿蛋白質(zhì)提取、分離、鑒定以及生物信息學分析以及進一步對重要蛋白進行細胞內(nèi)定位、功能等深入研究的技術(shù)體系。在男性不育方面，早期研究者利用2-DE電泳-質(zhì)譜技術(shù)體系建立了不育男性和正常男性差異精子蛋白數(shù)據(jù)庫，并從中發(fā)現(xiàn)了一些重要功能蛋白[5]。在家畜上，一些研究者利用2-DE電泳結(jié)合蛋白質(zhì)定量檢測手段發(fā)現(xiàn)了一些與家畜性別相關(guān)的精子蛋白[6]。如Huang等[7]研究豬冷凍精子解凍后精子蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白-90（HSP-90)）解凍后含量明顯下降，推測該蛋白可能與精子運動性能相關(guān)；也有研究發(fā)現(xiàn)，公豬精子中存在一些與母豬窩產(chǎn)仔數(shù)高度相關(guān)性的標記蛋白，表明公豬是育種工作中提高窩產(chǎn)仔數(shù)指數(shù)不可忽視的因素[8]。

精漿作為動物精子的天然培養(yǎng)基，其中的蛋白即精漿蛋白在精子整個生理過程尤其在受精過程發(fā)揮著不可忽視的作用，也已引起研究者們的廣泛關(guān)注。研究已證實，在人[9]和家畜[10]等精漿中均存在種類豐富的蛋白，可能通過與精子表面結(jié)合來對精子產(chǎn)生影響，被認為是男性不育及雄性動物生殖障礙潛在的診斷標記。其中，Brandon等[11]在馬精漿中發(fā)現(xiàn)4種蛋白與公馬的生育能力相關(guān)；Bergeron等[12]認為綿羊精漿中的Spermadhesin族蛋白可能對精子獲能及精卵結(jié)合均有影響；Huang等[13]在豬精漿中發(fā)現(xiàn)1個熱應激蛋白HSP-70在高溫季節(jié)明顯降低，后證實HSP-70與豬子受精能力存在相關(guān)性。Caballero等[14]發(fā)現(xiàn)低濃度的Spermadhesin族蛋白PSP-I/PSP-II的異質(zhì)二聚體可以延長高倍稀釋豬精液的存活時間。此外，有研究也發(fā)現(xiàn)人類及家畜精漿中存在一些具有抗菌功能的蛋白（即抗菌肽）在維持精子正常生理功能中發(fā)揮著重要不可忽視的作用，精液中的抗菌肽提取、鑒定及生物合成也已成為當前生殖生物學領(lǐng)域一個研究熱點[15]。

1.2 RNA水平 隨著生命科學研究步入功能基因組學時代，在RNA水平研究特定生理功能狀態(tài)下細胞或組織基因的表達情況和調(diào)控規(guī)律，已成為一個重要的研究熱點。目前，RNA水平主要研究對象為mRNA、miRNA和lncRNA等，其中后二者為非編碼RNA，研究手段主要有基因芯片（Biochip或Microarray）和RNA-Seq等高通量方法?；蛐酒椒▽⑻崛NA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并進行熒光探針標記，通過檢測芯片上各點信號強弱衡量該探針目的基因的表達量，可以快速分析大量樣本，該技術(shù)局限性是分析高度依賴已知的基因組信息。而RNA-Seq測序技術(shù)不再需要設(shè)計探針，可對任意物種的整體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行檢測，可以揭示小RNA和新基因，已成為目前在RNA水平進行深入研究不可缺少的工具。

早期普遍認為，精子發(fā)生后轉(zhuǎn)錄功能處于停滯狀態(tài)，在被致密包裝精子中染色質(zhì)存在RNA的可能性很小。但隨后研究相繼發(fā)現(xiàn)，成熟精子不僅有種類繁多的RNA，且精子RNA在精子發(fā)生和存活及精卵結(jié)合等過程中都起著重要作用，并可能作為遺傳物質(zhì)進入卵母細胞[16]。然而，精子中的RNA含量極低，魚精蛋白和DNA等被高度壓縮且受細胞膜包裹，使得精子RNA提取一直是制約相關(guān)研究發(fā)展的瓶頸。近幾年來，精子RNA提取和擴增技術(shù)的突破以及高通量RNA-Seq技術(shù)有力地推動了精子在RNA水平研究。

精子RNA水平研究早期在男性不育領(lǐng)域較多，基因芯片（cDNA Microarrays）和高通量測序等手段先后廣泛應用，是男性不育生成機制及診斷研究發(fā)展的重要推動因素之一。在家畜中，轉(zhuǎn)錄組學在牛精子的相關(guān)研究中涉及較多。研究者們利用抑制消減雜交法（Suppression-Subtractive Hybridization，SSH）和基因芯片等技術(shù)在牛上進行了生育能力相關(guān)精子基因的篩選[17]。

近幾年來，無編碼功能的miRNA的生物學功能開始受到重視。已有研究證實，miRNA可通過其靶基因與相關(guān)信號通路建立相互調(diào)控及協(xié)同模式，間接實現(xiàn)了對細胞或生物體生理功能的調(diào)控[18]。在現(xiàn)有技術(shù)條件下，結(jié)合現(xiàn)有芯片技術(shù)和高通量測序技術(shù)，可實現(xiàn)高效、大規(guī)模地發(fā)掘，并對序列信息已知和未知miRNA進一步研究其基因調(diào)控功能。

通過對精子miRNA表達譜進行比較分析，也是探索男性不育及動物精子生理功能異常機制的有效途徑之一。在男性不育方面，Liu等[19]和Wang等[20]分別利用miRNA芯片和Solexa測序在男性精子和精漿中發(fā)現(xiàn)不育相關(guān)miRNA ；在哺乳動物方面，Lagos-Quintana等[21]首次報道在老鼠精子中發(fā)現(xiàn)影響胚胎發(fā)育的miRNA；Fagerlind等[22]在奶牛上篩選并鑒定了7個與生育力相關(guān)miRNA；在豬精子中[23]也已發(fā)現(xiàn)5個與精子形態(tài)和運動性能相關(guān)miRNA。

此外，研究者也發(fā)現(xiàn)RNA或蛋白發(fā)揮其生理調(diào)節(jié)功能均涉及眾多的信號通路，如miRNA被認為是基因調(diào)控和信號通路網(wǎng)絡(luò)中不可缺少的調(diào)節(jié)器，通過其靶基因與相關(guān)信號通路建立了相互調(diào)控及協(xié)同模式，間接實現(xiàn)了對細胞或生物體生理功能的調(diào)控[24]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-Activated Protein Kinase，AMPK）[25]即為與豬精子功能調(diào)控相關(guān)的重要信號通路。

2 家畜精子耐凍性機制研究動態(tài)

關(guān)于家畜精子耐凍性影響機制，研究者們先后在DNA、RNA和蛋白質(zhì)等水平分別從精子和精漿著手展開研究并取得了一些進展。在分子水平上，Thurston等[2]利用應用限制性片斷長度多態(tài)（Restriction Fragment Length Polymorphism，AFLP）方法發(fā)現(xiàn)16個豬精子耐凍性相關(guān)的候選基因，但闡明其確切機制仍存在較大局限性。

研究發(fā)現(xiàn)，動物精子經(jīng)冷凍-解凍過程會發(fā)生精子蛋白缺失、表達水平異常等，意味著精子比較蛋白質(zhì)組學研究可能是揭示其耐凍性影響機制的一條途徑[26]。在蛋白質(zhì)水平上，豬[27]和牛[28]等家畜的精子/精漿蛋白與其精子耐凍性之間存在顯著相關(guān)性。不同家畜個體的精漿在精液降溫過程中可增強抗“低溫打擊”能力，推測可能是某些精漿蛋白在降溫過程中發(fā)揮著主要作用[29]。在牛上，有研究發(fā)現(xiàn)精漿中BSP族蛋白不僅影響精子運動性能，還可能通過在冷凍前降溫平衡過程增強其精子抗“低溫打擊”能力從而影響精子的耐凍性[30]；Barrios等[31]和Rickard等[32]均證實在不同品種綿羊中存在一些與精子耐凍性相關(guān)的精漿蛋白。與其他家畜相比，豬精子在品種間和個體間耐凍性差異最為顯著[33]。在豬精子耐凍性方面，西班牙Bonet教授研究團隊先后利用免疫標記（Immunolabeling Assay）、雙向熒光差異凝膠電泳（2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis，2D-DIGE）結(jié)合 Western blot技術(shù)分離、鑒定了多個豬精子耐凍性相關(guān)蛋白[34]；Vilagran等[35]研究發(fā)現(xiàn)，皮特蘭豬的精漿蛋白fibronectin-1（FN1）與豬精子耐凍性存在相關(guān)性，可以作為評價精子耐凍性的標記蛋白。國內(nèi)對精子耐凍性在蛋白質(zhì)水平上研究僅見張欣宗等[36]報道，該研究利用2D-MS技術(shù)對在人精子/精漿的蛋白進行分離、鑒定和生物信息學分析，共計發(fā)現(xiàn)22個可能與人精子耐凍性相關(guān)的精子/精漿蛋白。

基于精子RNA水平研究是揭示一些精子奧秘的重要途徑之一，研究者也已展開了在RNA水平探索動物精子耐凍性影響的機制研究。Card等[37]首次將RNA –Seq技術(shù)引入牛冷凍精子，對由冷凍-解凍導致表達發(fā)生顯著變化的mRNA進行高通量篩選，并對其中的PRM1和HMGB4等進行了分析與驗證；Fraser等[38]證實了豬冷凍精子與常溫保存精子間mRNA表達水平存在顯著差異。筆者所在研究團隊利用RNA –Seq和iTRAQ手段分別在RNA和蛋白水平篩選、分析和鑒定耐凍性相關(guān)RNA和蛋白（待發(fā)表 ）。

3 展 望

隨著蛋白質(zhì)組學及轉(zhuǎn)錄組學等高通量手段的飛速發(fā)展及其在人類和家畜精子中廣泛應用，使得在DNA、RNA以及蛋白質(zhì)多個水平，以系統(tǒng)生物學的思路全面地探索家畜精子耐凍性影響機制成為可能。預期在不久的將來，家畜精子耐凍性影響機制將逐漸揭下面紗，家畜精液冷凍保存技術(shù)將實現(xiàn)質(zhì)的突破，從而推動家畜精液冷凍保存技術(shù)在種質(zhì)資源保護、育種和生產(chǎn)中廣泛應用，在提升優(yōu)秀種公畜種用價值乃至新品種培育等方面均有較大意義。

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Research Progress on the Mechanism of Domestic Animals Sperm Freezability

ZHANG Shu-shan, ZHANG De-fu*, DAI Jian-jun, WU Cai-feng

(Animal Husbandry and Veterinary Research Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences; Division of Animal Genetic Engineering, Shanghai Key Laboratory of Agri-Genetics and Breeding, Shanghai 201106, China)

Great inter-individual difference in domestic animal sperm freezability was found and it limited the development of semen cryopreservation technology. This paper summarized the recent development of sperm freezability in domestic animals so as to provide a reference for the revelation of sperm freezability mechanism.

Domestic animal; Sperm; Freezability

S814

A

10.19556/j.0258-7033.2017-12-009

2017-06-12；

2017-08-21

上海市自然科學基金（15ZR1430100）；上海市科委農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化專項（123919N0700、133919N1700）

張樹山（1976-），男，博士，副研究員，研究方向為動物繁殖生物技術(shù)，E-mail：smalltreexj@126.com

*通訊作者：張德福（1963-），男，博士，研究員，研究方向為動物繁殖生物技術(shù)，E-mail：zhangdefuzdf@163.com