何 芳 王 芳 張艷婷 李 鵬 楊少奇

(寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院消化科，寧夏 銀川 750004)

胃癌患者CD4+和CD8+T細胞的PD-1高表達與腫瘤免疫逃逸的關系

何 芳 王 芳 張艷婷 李 鵬 楊少奇

(寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院消化科，寧夏 銀川 750004)

目的探討胃癌患者CD4+和CD8+T細胞的程序性死亡受體(PD)-1與腫瘤免疫逃逸的關系。方法采用流式細胞術檢測胃癌患者外周血中CD4+、CD8+T細胞的PD-1表達情況；分析胃癌患者外周血單核細胞PD-L1表達情況；比較胃癌組織、胃癌患者外周血與健康人胃黏膜中CD4+、CD8+T細胞的PD-1表達情況；酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)分析胃癌組織中表達PD-1陽性與PD-1陰性的CD4+、CD8+T細胞因子分泌情況。結果胃癌患者外周血中CD4+、CD8+T細胞PD-1表達和單核細胞的PD-L1表達均顯著高于對照組(Plt;0.05)；胃癌組織中CD4+、CD8+T細胞表達的PD-1顯著高于胃癌外周血和正常人胃黏膜中的PD-1表達；胃癌組織中PD-1陽性的CD4+，CD8+T細胞分泌的相關細胞因子干擾素(IFN)γ、白細胞介素(IL)-17、granzymeB，腫瘤壞死因子(TNF)顯著低于PD-1陰性。結論胃癌患者體內(nèi)CD4+、CD8+T細胞高表達PD-1抑制了T細胞的功能，促進胃癌的免疫逃逸。

流式細胞術；T細胞；免疫逃逸；胃癌

程序性死亡受體(PD)-1是表達于被活化的CD4+與CD8+T細胞表面的免疫抑制性受體〔1，2〕。PD-L1與PD-L2是PD-1的配體〔3，4〕。PD-1/PD-L1的相互作用對于維持正常機體的外周免疫耐受中有重要作用〔5〕。研究表明，實體瘤中PD-L1的表達阻礙T細胞的抗腫瘤免疫反應〔6〕。在多種小鼠模型中的研究也發(fā)現(xiàn)，阻斷了PD-L1抑制腫瘤生長或延遲其發(fā)展進程〔6〕。胃癌死亡率高居全球第二位〔7〕。免疫系統(tǒng)無法驅動對胃癌細胞的免疫反應〔8,9〕。然而，對于胃癌是如何戰(zhàn)勝機體免疫反應的機制目前還知之甚少。本文通過檢測CD4+與CD8+T細胞上PD-1的表達情況，探究胃癌免疫逃逸的可能機制。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 細胞培養(yǎng)基(RPMI,10%FBS,55 μmol/L 2-mercaptoethanol,2 mmol/L L-glutamine,10 μg/ml gentamicin，10 μmol/L HEPES)流式分析儀器：BD公司的Calibure。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒與流式熒光抗體均購自ebioscience公司。

1.2受試者樣本 選取寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院2016年1～12月住院行手術治療的胃癌患者，病理活檢明確診斷為胃癌。年齡42～76歲，自愿參加本研究，研究前均未接受放射性治療、化療或其他治療。健康體檢人群為對照組，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.3外周血單個核細胞提取 取受試者15 ml外周血，采用Ficoll-Paque(Pharmacia,Uppsala,Sweden)梯度離心。

1.4腫瘤浸潤淋巴細胞提取 將術后病理標本切碎，用2 mg/ml膠原酶D(Roche)消化，37℃，1 h，得到的細胞懸液用200目濾膜過濾。

1.5流式細胞術分析樣品的制備

1.5.1細胞刺激 將分離得到的細胞重懸在1 ml 細胞培養(yǎng)基中，加入50 ng/ml PMA和1 μg/ml離子霉素，37℃細胞培養(yǎng)箱中刺激4 h后收上清，用ELISA試劑盒測細胞因子含量。

1.5.2流式抗體標記 將細胞重懸在200 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)中，按照1×106細胞標2 μl流式抗體。置于4℃冰箱中避光孵育20 min，用1 ml PBS洗1次。見300 μl PBS上流式儀器分析。

1.6統(tǒng)計學方法 應用Graph Pad Prism5.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1胃癌患者外周血中CD4+與CD8+T細胞PD-1表達 胃癌患者外周血中CD4+T細胞所表達的PD-1顯著高于對照組(32.4%±10.2% vs 24.6%±7.5%，P=0.008 3)。胃癌患者外周血中CD8+T細胞所表達的PD-1也顯著高于對照組(29.7%±9.2% vs 20.3%±6.8%，P=0.005 3)。

2.2胃癌患者外周血中CD4+單核細胞PD-L1表達 胃癌患者外周血中CD4+單核細胞中表達的PD-L1顯著高于對照組(16.5%±7.5% vs 4.4%±1.7%，Plt;0.000 1)。晚期胃癌外周血中CD4+單核細胞PD-L1的表達也顯著高于早期胃癌患者(21.2%±8.1% vs 12.9%±4.9%，Plt;0.000 1)。

2.3PD-1在胃癌組織CD4與CD8T細胞中的表達 胃癌組織CD4+T細胞表達PD-1(60.5%±10.5%)顯著高于胃癌患者外周血(21.8%±7.9%)與正常人胃黏膜的(46.5%±9.3%，Plt;0.000 1，P=0.003 1)。胃癌組織CD8+T細胞表達PD-1(57.6%±10.2%)顯著高于胃癌患者外周血(20.3%±7.3%)與正常人胃黏膜的(42.7%±9.8%，Plt;0.000 1，P=0.002 3)。

2.4胃癌組織中表達PD-1的CD4+與CD8+T細胞功能 PD-1陽性的CD4+T細胞分泌干擾素(IFN)γ〔(46.2±3.3)pg/ml〕與白細胞介素(IL)-17〔(21.7±1.6)pg/ml〕顯著少于PD-1陰性的CD4+T細胞〔(103.5±4.8)pg/ml，(42.8±3.1)pg/ml；P=0.004 3，P=0.002 7〕。PD-1陽性的CD8+T細胞分泌IFNγ〔(16.3±2.1)pg/ml〕、granzymeB〔(15.7±1.3)pg/ml〕、腫瘤壞死因子(TNF)-α〔(7.8±0.5)pg/ml〕也顯著少于PD-1陰性的CD8+T細胞〔(53.5±2.9)pg/ml，(32.9±2.6)pg/ml，(22.5±2.2)pg/ml；Plt;0.000 1，P=0.003 9，P=0.001 6〕。

3 討 論

共信號分子是表達于細胞表面的糖蛋白，能夠直接調(diào)控T細胞受體的信號通路?；谄涔δ芴匦裕梢詫⒐残盘柗肿臃譃楣泊碳し肿优c共抑制分子，分別是刺激T細胞活化或抑制T細胞活化。在恰當?shù)臅r間與位置上表達共信號分子，可以促進或抑制T細胞免疫反應，包括影響T細胞的生長，分化和功能成熟。PD-1和PD-L1分別是共信號分子與共抑制分子。結合了配體PD-L1與PD-L2后，PD-1會傳遞共抑制信號。通過抗體阻斷PD-1信號通路能夠增加體內(nèi)的病毒特異CD8+T細胞的免疫反應，增強CD8+T細胞的增殖，細胞因子產(chǎn)生，效應活性，使病毒量降低。最近的一項研究表明，被病毒感染的失能T細胞高表達PD-1，通過阻斷PD-1信號通路后能夠增強T細胞體外免疫反應〔10〕。另外，癌癥患者里T細胞功能的受損似乎與表達PD-1相關〔10〕。然而，在胃癌患者中，PD-1表達的情況還有待被闡明。本研究結果提示，上調(diào)PD-1表達與腫瘤環(huán)境中CD4+與CD8+T細胞功能相關，并且PD-1的表達抑制了腫瘤環(huán)境中CD4+與CD8+T細胞的免疫反應。PD-L1在多種腫瘤中都表達，是免疫抑制環(huán)境中的一種成分〔11〕。盡管未檢測胃癌細胞中PD-L1表達情況，在最近的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞中高表達PD-L1與胃癌患者不良的預后效果相關〔12〕。而PD-L1通常表達于抗原提呈細胞，如樹突細胞、巨噬細胞、單核細胞等。

1Urban JL,Schreiber H.Tumor antigens〔J〕.Annu Rev Immunol,1992;10:617-44.

2Sharpe AH,Wherry EJ,Ahmed R,etal.The function of programmed cell death 1 and its ligands in regulating autoimmunity and infection〔J〕.Nat Immunol,2007;8(3):239-45.

3Tseng SY,Otsuji M,Gorski K,etal.B7-DC,a new dendritic cell molecule with potent costimulatory properties for T cells〔J〕.J Exp Med,2001;193(7):839-46.

4Latchman Y,Wood CR,Chernova T,etal.PD-L2 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation〔J〕.Nat Immunol,2001;2(3):261-8.

5Keir ME,Freeman GJ,Sharpe AH.PD-1 regulates self-reactive CD8+T cell responses to antigen in lymph nodes and tissues〔J〕.J Immunol,2007;179(8):5064-70.

6Hirano F,Kaneko K,Tamura H,etal.Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity〔J〕.Cancer Res,2005;65(3):1089-96.

7Parkin DM,Bray F,Ferlay J,etal.Global cancer statistics,2002〔J〕.CA Cancer J Clin,2005;55(2):74-108.

8Inoue H,Mori M,Honda M,etal.The expression of tumor-rejection antigen ''MAGE'' genes in human gastric carcinoma〔J〕.Gastroenterology,1995;109(5):1522-5.

9Hoshino T,Seki N,Kikuchi M,etal.HLA class-I-restricted and tumor-specific CTL in tumor-infiltrating lymphocytes of patients with gastric cancer〔J〕.Int J Cancer,1997;70(6):631-8.

10Matsuzaki J,Gnjatic S,Mhawech-Fauceglia P,etal.Tumor infiltrating NY-ESO-1-specific CD8+T cells are negatively regulated by LAG-3 and PD-1 in human ovarian cancer〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2010;107(17):7875-80.

11Brown JA,Dorfman DM,Ma FR,etal.Blockade of programmed death-1 ligands on dendritic cells enhances T cell activation and cytokine production〔J〕.J Immunol,2003;170(13):1257-66.

12Wu C,Zhu Y,Jiang J,etal.Immunohistochemical localization of programmed death-1 ligand-1(PD-L1)in gastric carcinoma and its clinical significance〔J〕.Acta Histochem,2006;108(1):19-24.

〔2017-04-16修回〕

(編輯 袁左鳴)

R73

A

1005-9202(2017)22-5505-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.009

寧夏自然科學基金項目(No.NZ15150)

楊少奇(1973-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤、慢性肝病研究。

何 芳(1981-)，女，碩士，主要從事消化道癌癥相關研究。