毛愛民 楊芝芬 馮嘉林 陸宇超 金嘉旻 韓奇宏

(無錫市動物疫病預防控制中心，江蘇無錫 214021)

生豬偽狂犬病的實驗室診斷技術(shù)

毛愛民 楊芝芬 馮嘉林 陸宇超 金嘉旻 韓奇宏

(無錫市動物疫病預防控制中心，江蘇無錫 214021)

豬偽狂犬病是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一，該病實驗室主要診斷技術(shù)有病毒分離鑒定、聚合酶鏈式反應、家兔接種試驗、中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、膠乳凝集試驗等。本文重點介紹了病毒分離鑒定、家兔接種試驗、ELISA試驗三種方法，同時針對解剖技術(shù)、病理變化進行了相關(guān)技術(shù)分析。

偽狂犬病 gB抗體 gE抗體 病理

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PrV）引起的豬的急性傳染病，也稱奧耶斯基氏?。ˋujeszky's disease），該病在豬呈爆發(fā)性流行，引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎，公豬不育，新生的仔豬大量死亡，育肥豬呼吸困難、生長停滯等，臨床上以發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎和神經(jīng)節(jié)炎為特征，是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一。

該病可根據(jù)臨診癥狀，結(jié)合流行病學，可做出初步診斷，確診必須進行實驗室檢查。主要診斷技術(shù)有病毒分離鑒定、聚合酶鏈式反應、家兔接種試驗、中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、膠乳凝集試驗等，其中前三種適用于偽狂犬病毒檢測，中和試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗適用于狂犬病免疫抗體和非免疫抗體檢測，最后一種適用于實驗室和現(xiàn)場早期進行偽狂犬病抗體檢測。目前，常用的實驗室診斷方式為病毒分離鑒定、家兔接種試驗、酶聯(lián)免疫吸附實驗。

1 病毒分離鑒定

病毒分離鑒定是診斷偽狂犬病的可靠方法。患病生豬的腦、心、肝、脾、肺、腎、扁桃體、鼻咽分泌物等均可用于病毒的分離的病料組織，但以腦組織和扁桃體最為理想。病料處理后可直接接種敏感細胞，如豬腎傳代細胞（PK-15和IBRS-2）、倉鼠腎傳代細胞（BHK-21），將病料按國標方法處理接種后進行培養(yǎng)，接種后36～72h內(nèi)可出現(xiàn)典型的細胞變圓、拉網(wǎng)、脫落等病變效應。若初次接種無細胞病變，可盲傳3代，如仍無細胞病變，則判為偽狂犬病毒檢測陽性。

2 家兔接種試驗

采取病豬腦組織、扁桃體、淋巴結(jié)等，混合剪碎、研磨，用生理鹽水制成10%乳懸液，同時每1ml加青、鏈霉素各1000IU，離心取上清液接種于家兔皮下，每只2ml（用于接種的家兔必須事先用中和試驗、膠乳凝集試驗或ELISA試驗等檢測偽狂犬病病毒抗體陰性者才能使用），家兔經(jīng)1～2d注射部位出現(xiàn)奇癢，家兔先用舌舔接種部位，以后用力撕咬接種部位，使接種部位被撕咬傷、鮮紅、出血，持續(xù)4～6h，病兔衰竭，倒臥于一側(cè)，痙攣，呼吸困難而死亡，為偽狂犬病毒感染陽性。如接種家兔仍健活，為陰性。

3 ELISA試驗

因目前我國豬場使用的豬偽狂犬病疫苗基本都是gE基因缺失苗，因此可以用ELISA抗體檢測技術(shù)進行野毒感染鑒別和免疫抗體水平監(jiān)測，其中偽狂犬病gE抗體檢測盒檢測豬血清中是否存在gE野毒抗體，鑒別有無感染偽狂犬病野毒，偽狂犬病gB抗體檢測盒主要檢測偽狂犬免疫抗體水平，但分析前提是群體gE陽性很低或均為陰性（如果gE抗體陽性，則gB抗體有部分來自野毒感染后產(chǎn)生的抗體），只有很高的偽狂犬抗體才可以抵抗偽狂犬病毒的感染（gB陽性率＞90%、離散度＜40），同時高抗體可以降低偽狂犬排毒。該方法是豬場特別是種豬場進行偽狂犬病凈化的主要檢測技術(shù)，具體操作方法見檢測盒說明書。對于兩種檢測盒可出現(xiàn)3種情況，分別為：gB-、gE-，沒有免疫，沒有感染；gB+、gE-，免疫合格，沒有感染；gB+、gE+，感染（免疫或未免疫）。而gB-、gE+，是不可能出現(xiàn)的。

4 病死豬解剖技術(shù)

偽狂犬病死豬如要做病毒分離、家兔接種、病理分析等實驗，必須要掌握病死豬解剖技術(shù)。要按下列步驟依次進行：進行外部檢查、固定剖腹檢查臟器、腹腔器官的采出與檢查、胸腔剖開與各器官的檢查、顱腔剖開、口腔和頸部器官采出。在做解剖工作的同時一定要注意以下事項：一是在豬死亡以后，尸體剖檢進行越快、準確診斷的機會越多。夏季須在死后4～8h之內(nèi)完成，冬季不得超過18～24h。二是剖檢中要做記錄和拍照，將每項檢查的各種異常現(xiàn)象詳細記錄下來，同時將肉眼病變組織拍照，以便做出初步診斷。三是剖檢過程中要注意個人防護，穿好防護服、帶好口罩、手套，防止感染。四是尸體剖檢后要進行無害化處理，如深埋、焚燒等。剖檢完后所用的器具、臺面、地面等都要進行嚴格的消毒處理。

5 病理變化

我國2011年后產(chǎn)生豬偽狂犬病毒株經(jīng)國內(nèi)各科研院所的專家團隊深入研究，推測為變異毒株，因此為了更好地進行生豬偽狂犬病診斷分析，動物疫病預防控制中心在以豬主要病原均為陰性的仔豬為基礎(chǔ)上建立的豬偽狂犬病毒變異株單因子發(fā)病模型實驗，從實驗來看病理肉眼變化明顯的器官主要有：腦組織水腫；腎臟紅色針尖狀出血點，有的腫大，有黃疸；扁桃體出血，有兩頭有潰瘍；肝臟：出現(xiàn)白色針尖狀壞死點；肺臟：出血，水腫；淋巴結(jié)腫大出血。取病變組織，常規(guī)石蠟切片，HE染色，鏡檢主要組織病理變化。病死豬主要變化為：肝臟的門靜脈、匯管區(qū)以及竇狀隙瘀血，并伴有肝小葉的大量出血，干細胞變性壞死；肺臟的肺泡內(nèi)大量出血，肺間質(zhì)增寬；腦內(nèi)呈現(xiàn)噬神經(jīng)元現(xiàn)象等非化膿性腦炎典型病變；脾臟：淋巴細胞缺失，有壞死灶。

[1]宣長和，馬春全.豬病學（第三版）[M].中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2010.

江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程項目“生豬偽狂犬病綜合防控技術(shù)的推廣應用”，合同編號：SXGC[2015]024。