王友剛 羅永光 杜光波

（淮安生物工程高等職業(yè)學(xué)校，江蘇淮安 223200）

山羊急性咳喘的病原體檢測(cè)

王友剛 羅永光 杜光波

（淮安生物工程高等職業(yè)學(xué)校，江蘇淮安 223200）

在流行病學(xué)調(diào)查、臨床診斷、病理剖檢的基礎(chǔ)上，對(duì)一家肉羊場(chǎng)發(fā)生的羊群急性咳喘、急性死亡的病例進(jìn)行病原實(shí)驗(yàn)室分離鑒定、PCR檢測(cè)，確診為一起以綿羊支原體感染為主的羊傳染性胸膜肺炎。

山羊 咳喘 病原檢測(cè) 羊傳染性胸膜肺炎

近年來(lái)，淮安地區(qū)肉羊規(guī)模養(yǎng)殖發(fā)展迅速，幾百頭到數(shù)千頭規(guī)模養(yǎng)羊場(chǎng)如雨后春筍般的出現(xiàn)。隨著規(guī)模化、集約化肉羊養(yǎng)殖發(fā)展，羊在高密度舍飼情況下，疫病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，尤其是許多養(yǎng)殖戶為了短期內(nèi)擴(kuò)張羊場(chǎng)規(guī)模，隨意引種，導(dǎo)致羊場(chǎng)病原多樣化、復(fù)雜化。

2016年8月，淮安某羊場(chǎng)因?yàn)槊つ恳N，導(dǎo)致一場(chǎng)較大規(guī)模疫病流行，損失嚴(yán)重。經(jīng)過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、臨床診斷、病理剖檢和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，確定了主要病原，制定了中西醫(yī)結(jié)合防治方案，及時(shí)控制了疫病，現(xiàn)將病原檢測(cè)情況報(bào)告如下：

1 發(fā)病情況

淮安某羊場(chǎng)飼養(yǎng)了356頭波雜種羊和538頭波雜羊育肥羊，羊群接種過(guò)了山羊傳染性胸膜肺炎疫苗、羊痘疫苗、三聯(lián)四防疫苗和小反芻獸疫疫苗。2016年8月份，又從外地收購(gòu)25～30kg的土種山羊300頭，飼養(yǎng)于場(chǎng)里獨(dú)立一間羊舍，沒(méi)有和本場(chǎng)羊群混合。外地羊群入場(chǎng)后第3d開(kāi)始，連續(xù)有羊發(fā)生咳嗽氣喘、流膿樣鼻涕和零星死亡，第7d起，病情突然加重，羊群出現(xiàn)普遍發(fā)呆、發(fā)熱、氣喘和劇烈咳嗽，每天死亡17～20頭，經(jīng)過(guò)當(dāng)?shù)孬F醫(yī)治療，效果一直不明顯。第10d，發(fā)現(xiàn)本場(chǎng)原有的羊群也開(kāi)始出現(xiàn)氣喘、咳嗽和流膿樣鼻涕。

2 實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備

2.1 試劑

血瓊脂平板培養(yǎng)基、含精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基、含精氨酸支原體瓊脂固體培養(yǎng)基都購(gòu)于百思生物科技公司。

2.2 設(shè)備

二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、全自動(dòng)高壓滅菌鍋、全自動(dòng)熒光PCR檢測(cè)儀及其配套試劑盒，由淮安生物工程高等職業(yè)學(xué)校羊病檢測(cè)中心提供。

3 診斷

3.1 詢問(wèn)疫情

查看獸醫(yī)治療記錄、防疫記錄、疫苗、使用的藥品和治療效果。

3.2 臨床檢查

現(xiàn)場(chǎng)觀察臨床癥狀、聽(tīng)診和檢測(cè)體溫。

3.3 尸體剖檢

現(xiàn)場(chǎng)解剖病死羊5頭。

3.4 病料采集

無(wú)菌采集病死羊病變肺部組織、氣管分泌物、胸腔積液、心包積液、心血、肝臟、脾臟、腎臟；無(wú)菌采集活的病羊血液。

3.5 病原體檢測(cè)

3.5.1 病原體分離培養(yǎng)

（1）培養(yǎng)基制備

含精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基 稱取本品25.52g，加熱溶解于800ml蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，冷至室溫，無(wú)菌操作加入滅活小牛血清200ml和青霉素80萬(wàn)IU，混勻，分裝無(wú)菌試管備用。

含精氨酸支原體瓊脂固體培養(yǎng)基 取支原體瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基45g、蒸餾水1000ml加熱溶解，121℃高壓滅菌15min后，待冷卻至55℃左右加入預(yù)熱到55℃的小牛血清100ml、青霉素80萬(wàn)IU，混勻，無(wú)菌分裝平皿。以上培養(yǎng)基4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）分離培養(yǎng)

將采集的新鮮病料去除漿膜，無(wú)菌采集深層組織1小塊，再加少量的生理鹽水混合，在滅菌的玻璃研磨器里研磨勻漿，將勻漿液分裝于1.5ml的EP管3000r/min離心2min，取0.3μm接種于血瓊脂平板培養(yǎng)基，再取上清液再經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后，取0.3ml分別接種于支原體肉湯培養(yǎng)基、支原體瓊脂平板培養(yǎng)基，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱，控制5%二氧化碳，37℃，加濕，培養(yǎng)7d，其間不斷觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。當(dāng)液體呈橘黃色時(shí)，按1：5的接種量盲傳兩次，直至培養(yǎng)物變?yōu)辄S色，將變黃的培養(yǎng)物畫線接種于固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，挑取單個(gè)典型菌落純化3次后，獲得純培養(yǎng)物。

（3）涂片鏡檢

分別取肉湯和瓊脂平板上的純培養(yǎng)物涂片，瑞士和革蘭氏染色染色鏡檢。

3.5.2 PCR檢測(cè)

將無(wú)菌采集的病死羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟，研磨后反復(fù)凍融3次，勻漿器磨細(xì)，收集勻漿，12000r/min離心10min，取上清液，并與采集的羊血清一起分別進(jìn)行快速熒光PCR檢測(cè)。

4 體會(huì)

4.1 治療效果

當(dāng)?shù)孬F醫(yī)曾經(jīng)使用青霉素、鏈霉素、恩諾沙星、氟苯尼考進(jìn)行注射和口服，治療效果不明顯，沒(méi)有緩解癥狀，死亡日益增加。

4.2 臨床癥狀

發(fā)病羊表現(xiàn)精神沉郁，食欲廢絕，步態(tài)蹣跚，呼吸困難，張口伸脖，咳嗽，痛苦呻吟，有的倒地不起，四肢平展，口流黏液，鼻腔有膿樣鼻涕，體溫40℃～41.5℃，聽(tīng)診肺部有明顯濕羅音和摩擦音，部分羊眼瞼腫脹、流淚，口腔黏膜有潰瘍，有些羊有腹瀉癥狀。

4.3 病理變化

解剖5頭病死羊，病變比較一致，主要病變?yōu)?，胸腔積液多而渾濁，肺嚴(yán)重肝變，切面較硬，呈現(xiàn)大理石樣，局部有灰黃色壞死區(qū)域，有些部位有化膿灶，胸膜和肺粘連，心包增厚，外有多量纖維樣物質(zhì)，心包積液。食道、真胃、盲腸、結(jié)腸近端和直腸未見(jiàn)條狀充血、出血現(xiàn)象，其他器官也無(wú)明顯病理變化。

4.4 實(shí)驗(yàn)室病原檢測(cè)

4.4.1 分離培養(yǎng)

支原體肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)48h變?yōu)殚冱S色，72h變?yōu)辄S色。支原體瓊脂培養(yǎng)基24～48h無(wú)可見(jiàn)菌落，72h有針尖大小露珠樣菌落，96h，菌落稍微變大，放大鏡下觀察，呈現(xiàn)扁平煎蛋狀。血瓊脂平板培養(yǎng)基，72h也長(zhǎng)出針尖大小露珠狀菌落，沒(méi)有其他菌落出現(xiàn)。

4.4.2 涂片鏡檢

取純培養(yǎng)物涂片革蘭氏染色和瑞氏染色鏡檢，可見(jiàn)細(xì)小桿狀、球形、卵圓形、環(huán)狀等多形態(tài)微小菌體；革蘭氏染色陰性。

4.4.3 PCR檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)過(guò)快速熒PCR檢測(cè)，結(jié)果血清和病料提取液中，都含有綿羊支原體。

5 討論

該羊場(chǎng)羊群肺炎急性流行，經(jīng)過(guò)臨床癥狀、病理變化、病原分離和PCR檢測(cè)，確診為綿羊支原體感染。但是，羊急性肺炎病因比較復(fù)雜，病原較多，主要有支原體、巴斯德菌、鏈球菌等等。由于病原分離所取的病料，都是來(lái)源于已經(jīng)注射過(guò)多種抗菌藥物的病羊，有可能還有其他病原體混合感染，因?yàn)槎喾N抗生素的注射，可能已經(jīng)殺死了其他混合感染的細(xì)菌，而支原體對(duì)所注射的抗菌藥物有耐藥性，所以血瓊脂培養(yǎng)基只有支原體生長(zhǎng)，沒(méi)有其他細(xì)菌生長(zhǎng)，這不代表沒(méi)有其他病原混合感染的可能。

該羊場(chǎng)本次肺炎急性流行，主要是由于盲目收購(gòu)散養(yǎng)戶羊群，引進(jìn)帶菌羊，加上環(huán)境應(yīng)激而引起發(fā)的以羊支原體感染為主的肺炎的暴發(fā)。羊場(chǎng)其他羊群雖然已經(jīng)進(jìn)行了山羊傳染性胸膜肺炎疫苗注射，但是，仍然有部分羊群感染，主要原因是疫苗毒株是山羊支原體而不含綿羊支原體，本次感染的是綿羊肺炎支原體。山羊傳染性胸膜肺炎是由山羊支原體引起的一種高度接觸性傳染病。其臨床特征是以高熱、咳喘、急性纖維性肺炎和胸膜炎。發(fā)病率為22%～30%，有的地區(qū)高達(dá)60%～80%，死亡率為15%～30%，對(duì)世界各國(guó)的養(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)巨大的損失。國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果表明，引起山羊傳染性胸膜肺炎的支原體有多種，我國(guó)羊傳染性胸膜肺炎病原主要為絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體。

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淮安地區(qū)肉羊規(guī)模養(yǎng)殖常見(jiàn)疫病預(yù)防技術(shù)研究與推廣；（SXGC[2015]156）防治羊大腸桿菌病的微生態(tài)中藥制劑的研制（HAN2015029）