丁志超（綜述） 涂 蓉（審校）

小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體在分子靶向顯像研究中的應(yīng)用

丁志超（綜述） 涂 蓉（審校）

分子影像學(xué)；肽類；分子探針；體層攝影術(shù)，光學(xué)；磁共振成像；綜述

隨著近年來精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的提出，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有了新的內(nèi)容和發(fā)展方向。分子影像學(xué)是開展精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的載體和主要手段之一，是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的重要組成部分[1]。分子影像學(xué)是指借助于分子探針，運(yùn)用成像設(shè)備（主要包括放射性核素成像、MRI、光學(xué)成像、超聲成像及CT成像）實(shí)時(shí)觀測活體細(xì)胞、組織乃至整個(gè)系統(tǒng)在細(xì)胞甚至分子水平發(fā)生的生理、生化事件[2]。與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)影像能夠直觀顯示病變形態(tài)學(xué)結(jié)果不同，分子影像可針對特定分子的表達(dá)與活性和生物學(xué)過程進(jìn)行顯像[3]。分子顯像劑又稱為分子探針，其具有3個(gè)基本要素：具體的靶點(diǎn)、能將對比劑帶向靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體及顯像劑[4]。本文主要對分子靶向顯像劑中轉(zhuǎn)運(yùn)載體的種類和特點(diǎn)以及小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體在光學(xué)和MRI中的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展進(jìn)行綜述。

1 轉(zhuǎn)運(yùn)載體的種類和特點(diǎn)

轉(zhuǎn)運(yùn)載體指能將顯像劑運(yùn)轉(zhuǎn)到特定靶點(diǎn)的物質(zhì)，具有與靶分子高度的親和力和結(jié)合的特異性，其主要通過攜帶顯像物質(zhì)與靶向性物質(zhì)偶聯(lián)，利用抗原-抗體、受體-配體、特異蛋白、核酸鏈之間等結(jié)合的原理實(shí)現(xiàn)。轉(zhuǎn)運(yùn)載體從先前轉(zhuǎn)運(yùn)單個(gè)顯像物質(zhì)的單模分子成像發(fā)展到轉(zhuǎn)運(yùn)多種顯像物質(zhì)的多模成像，甚至是近年來的雙模雙靶點(diǎn)成像，使得分子靶向成像效果更佳。目前，進(jìn)行分子靶向顯影的轉(zhuǎn)運(yùn)載體主要包括小肽、多肽、蛋白、抗體、適配體等。雖然有學(xué)者在研究中驗(yàn)證了這些轉(zhuǎn)運(yùn)載體特異的靶向能力，但有研究發(fā)現(xiàn)了諸多不足：抗體、蛋白質(zhì)體積較大，在活體內(nèi)容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬而無法到達(dá)靶區(qū)；單克隆抗體存在嚴(yán)重的免疫源性；適配體性能不穩(wěn)定，重復(fù)性不佳[5-6]。小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體由數(shù)個(gè)氨基酸組成，可將顯像劑轉(zhuǎn)運(yùn)到特定靶點(diǎn)，其分子量小，具有良好的組織滲透性、代謝穩(wěn)定性和快速性以及可耐受多種修飾等特點(diǎn)，是分子靶向成像的一個(gè)良好平臺，具有良好的研究和應(yīng)用價(jià)值[7-8]。

2 常用小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體研究

在分子靶向顯像研究中，分子成像靶點(diǎn)的選擇是分子成像技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。針對不同靶點(diǎn)小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的結(jié)構(gòu)不同，主要由相應(yīng)靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定。就小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的靶點(diǎn)而言，主要集中在整合素家族、CD13抗原（APN）、低糖基化黏蛋白-1（underglycosylated mucin-1，uMUC1）、纖維蛋白（ fi brin，F(xiàn)b）、纖維連接蛋白（ fi bronectin，F(xiàn)N）及其復(fù)合物纖維蛋白-纖維連接蛋白等。

2.1 靶向整合素受體的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體研究 腫瘤血管生成依賴于血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和侵襲，主要受血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）和細(xì)胞黏附受體整合素的調(diào)節(jié)[9]。整合素是存在于細(xì)胞間隙和基底膜上的一種能促進(jìn)細(xì)胞黏附和遷移的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白受體家族，是由α和β亞基非共價(jià)鍵結(jié)合形成的跨膜異二聚體糖蛋白[10]。在整合素家族中，整合素αvβ3在腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移中作用最為廣泛，研究也最為成熟[10]。整合素αvβ3在上皮細(xì)胞和成熟內(nèi)皮細(xì)胞處于低水平，但在多種實(shí)體腫瘤（如骨肉瘤、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌）細(xì)胞和腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞上高表達(dá)[11-12]。整合素αvβ3又稱為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）依賴整合素，能與含有RGD序列的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白特異性結(jié)合[13]?；诖?，Hu等[14]以整合素αvβ3為靶點(diǎn)，小肽RGD為轉(zhuǎn)運(yùn)載體與顯像劑熒光素/Gd-DOTAGA和二氧化硅納米粒子結(jié)合，合成熒光-MR雙模態(tài)納米分子探針GD-MSNs-RGD并進(jìn)行細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。熒光和MRI細(xì)胞（人惡性膠質(zhì)瘤U87MG）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)靶向性分子探針GD-MSNs-RGD與整合素αvβ3有良好的特異結(jié)合能力。進(jìn)一步對荷人惡性膠質(zhì)瘤U87MG（αvβ3過表達(dá)）和人表皮癌A431（αvβ3低表達(dá)）裸鼠模型進(jìn)行對照性實(shí)驗(yàn)，通過尾靜脈分別注射分子探針1、6 h后，T1加權(quán)成像靶向性探針GD-MSNs-RGD組U87MG腫瘤比A431腫瘤有明顯強(qiáng)化（U87MG腫瘤是A431腫瘤強(qiáng)化信噪比的2.3倍），非靶向性探針GD-MSNs-PEG（無REG配體）組未觀察到2種移植瘤強(qiáng)化。通過細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均驗(yàn)證了靶向性納米探針GD-MSNs-RGD對過表達(dá)整合素αvβ3移植瘤有更高的靈敏度和良好的靶向性。

近年來，在整合素受體家族研究中，其他整合素受體成員也取得了一定進(jìn)展。整合素αvβ6在正常上皮細(xì)胞和上皮良性腫瘤細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)，但在多種上皮來源的惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15]。Zhang等[16]以整合素αvβ6為靶點(diǎn)，胱氨酸結(jié)合肽（cysteineknot peptide，R01）為轉(zhuǎn)運(yùn)載體與熒光染料Atto740結(jié)合，合成光聲-熒光雙模分子探針A740-R01，并對荷人上皮腫瘤A431（整合素αvβ6陽性）、人胚腎細(xì)胞293T（整合素αvβ6陰性）裸鼠模型進(jìn)行對照性光聲-熒光成像實(shí)驗(yàn)。在注射A740-R01 1 h后，靶向組（A431荷瘤鼠）移植瘤熒光信號強(qiáng)度是非靶向組（293T荷瘤鼠）的7.5倍，說明雙模態(tài)分子探針A740-R01對整合素αvβ6特異的靶向性，為其他整合素家族成員靶向成像探針的開發(fā)拓展了思路。

分子影像學(xué)成像效果受探針特異性、敏感性、通透性等多種因素影響。單靶點(diǎn)成像往往使分子探針與相應(yīng)靶點(diǎn)結(jié)合不足；而在腫瘤生長過程中，其細(xì)胞表面往往有多種受體表達(dá)，這為雙靶點(diǎn)雙模態(tài)分子靶向成像的出現(xiàn)創(chuàng)造了條件。楊蕊夢等[17]以整合素αvβ3和胃泌素釋放肽受體（gastrin releasing peptide receptor，GRPR）為雙靶點(diǎn)，小肽RGD和蛙皮素（bombesin，BBN）為轉(zhuǎn)運(yùn)載體與油溶性量子點(diǎn)Q1605（quantum dots，QDs）、超順磁性氧化鐵（superparamagnetic iron oxide，SPIO）結(jié)合，合成磁性-熒光雙模態(tài)分子探針RGD@BBN-lipo（QDs）-SPIO并進(jìn)行細(xì)胞對比實(shí)驗(yàn)。MRI示RGD@BBN-lipo（QDs）-SPIO T2弛豫率是SPIO作為MRI對比劑T2弛豫率最低標(biāo)準(zhǔn)的8倍；普魯士藍(lán)和熒光成像示RGD@BBN-lipo（QDs）-SPIO可以靈敏地靶向整合素αvβ3和GRPR任何一個(gè)受體高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞（人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435 GRPR陰性，αvβ3陽性；人乳腺癌細(xì)胞T47D GRPR陽性，αvβ3降低）。由于其獨(dú)特的優(yōu)越性，相信會(huì)有更多優(yōu)質(zhì)的雙模雙靶點(diǎn)探針產(chǎn)生。

2.2 靶向抗原的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體研究 CD13受體是T細(xì)胞表面的一種抗原，又稱為氨肽酶N，以同源二聚體形式存在于細(xì)胞膜上。CD13在正常脈管系統(tǒng)細(xì)胞表面幾乎不表達(dá)，而在血液系統(tǒng)惡性腫瘤和多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞及其新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高表達(dá)，如肝癌、肺癌、乳腺癌、急性髓性白血病、纖維肉瘤等[18-19]；小肽NGR（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，Arg-Gly-Asp）可特異性地與腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞上的CD13受體結(jié)合[20]?；诖?，陳賢飛等[21]以NGR為轉(zhuǎn)運(yùn)載體先后與熒光染料、Gd結(jié)合，分別合成熒光-NGR、雙模態(tài)熒光-NGRGd分子探針，并進(jìn)行體外細(xì)胞對照實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組、拮抗組用HT1080細(xì)胞、對照組用HT29細(xì)胞；結(jié)果顯示2種分子探針實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度均高于對照組及拮抗組（2～3倍）；半定量對比分析結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但其缺少動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證NGR的靶向性和相關(guān)性能的檢測。Li等[22]同樣以NGR為轉(zhuǎn)運(yùn)載體與熒光染料CY5.5結(jié)合，合成熒光分子探針Cy5.5-NGR2并對荷人纖維肉瘤HT-1080細(xì)胞（CD13過表達(dá)）小鼠模型進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組（Cy5.5-NGR2）移植瘤肌肉熒光強(qiáng)度比是對照組（等量的NGR和Cy5.5-NGR2）的2.5倍，進(jìn)一步驗(yàn)證了小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體NGR對CD13受體良好的靶向能力。

靶向抗原的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體研究中不僅有常用的NGR小肽，針對不同抗原也開發(fā)出一些相應(yīng)的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體。黏蛋白-1（Mucin1，MUC1）是一種高糖基化跨膜糖蛋白，幾乎表達(dá)于所有黏膜上皮細(xì)胞。在正常黏膜上皮細(xì)胞表面起潤滑和保護(hù)作用，在多種上皮來源惡性腫瘤中異常表達(dá)、異常糖基化。uMUC1在多數(shù)腺上皮來源惡性腫瘤細(xì)胞上過表達(dá)，如結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等[23]。Wang等[24]以uMUC1靶向肽EPPT為轉(zhuǎn)運(yùn)載體，合成由葡聚糖氧化鐵納米粒子、Cy5.5和EPPT聚合的雙模態(tài)MN-EPPT分子探針，通過監(jiān)測荷胰腺癌小鼠模型化學(xué)治療后的變化來評估雙模態(tài)靶向探針的靶向能力。實(shí)驗(yàn)組用吉西他濱進(jìn)行化療，對照組用等量生理鹽水替代，分別在注射MN-EPPT前和注射24 h后進(jìn)行T2加權(quán)成像和熒光成像，并通過組織學(xué)和熒光定量PCR對兩組移植瘤uMUC1的表達(dá)水平進(jìn)行分析。T2加權(quán)成像結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和對照組化療后第7周移植瘤開始出現(xiàn)信號強(qiáng)度差異，之后逐漸明顯；熒光成像結(jié)果顯示：與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組在化療10周后移植瘤開始出現(xiàn)熒光強(qiáng)度減低，14周后明顯減低；組織學(xué)和熒光定量PCR結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組移植瘤uMUC1的表達(dá)明顯低于對照組，與影像學(xué)結(jié)果相吻合，說明靶向性探針MN-EPPT具有較高的靶向性和靈敏性，從而為分子靶向成像實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了一個(gè)新角度。

2.3 靶向纖維蛋白的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體其研究 Fb是一類不溶于水的蛋白質(zhì)，通常含有相同二級結(jié)構(gòu)的多肽鏈。研究表明，血栓形成與腫瘤生長有關(guān)[25-26]。血栓形成過程產(chǎn)生血凝，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周圍纖維蛋白和血小板沉積，纖維蛋白凝塊可以通過促血管生成因子的作用促進(jìn)腫瘤血管生成。在血栓和腫瘤中，即使微摩爾濃度的纖維蛋白也能與纖維蛋白靶向肽特異地結(jié)合，而不與血漿中纖維蛋白結(jié)合[26]?；诖?，Chaabane等[27]以Fb靶向肽為轉(zhuǎn)運(yùn)載體與Gd結(jié)合，合成MR分子探針Gd-F，并通過細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證分子探針Gd-F的靶向能力，通過使用抗血栓藥物來評估Gd-F對腫瘤位點(diǎn)上纖維蛋白變化的敏感性。T1加權(quán)成像示細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，人和小鼠血栓信號強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)組（靶向性探針Gd-F）比對照組（Gd-HPDO3A）增強(qiáng)5～14倍；荷神經(jīng)細(xì)胞瘤裸鼠模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組移植瘤信號強(qiáng)度比對照組增強(qiáng)6～10倍，腫瘤邊緣和間質(zhì)持續(xù)增強(qiáng)。經(jīng)抗血栓藥物（華法林）治療組比未作處理組腫瘤區(qū)強(qiáng)化面積減小，信號強(qiáng)度降低約1/3；從而證實(shí)了合成探針的特異靶向性和靈敏性，為監(jiān)測腫瘤生長和抗血栓治療中纖維蛋白的沉積創(chuàng)造了條件。

2.4 靶向纖維連接蛋白及其復(fù)合物的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體研究 FN是一種存在于細(xì)胞外基質(zhì)介導(dǎo)細(xì)胞黏附、遷移、損傷修復(fù)等過程的高分子糖蛋白。外結(jié)構(gòu)域-B纖維連接蛋白（extradomain-B fi bronectin，EDB-FN）是一種介導(dǎo)細(xì)胞黏附和遷移的高分子糖蛋白，是癌胚纖維連接蛋白（onfFN）的一種亞型。onfFN在腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)中非常豐富，在腫瘤形成、腫瘤血管生成及轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[28-29]；九環(huán)肽（CTVRTSADC，ZD2）結(jié)構(gòu)簡單，無免疫原性，能與EDB-FN特異性結(jié)合[30]。基于此，Han等[30]以EDB-FN為靶點(diǎn)，ZD2為轉(zhuǎn)運(yùn)載體與熒光染料Cy5.5結(jié)合，合成熒光分子探針ZD2-Cy5并進(jìn)行細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ZD2-Cy5能與前列腺癌PC3細(xì)胞分泌的EDB-FN特異性結(jié)合；荷前列腺癌PC3小鼠模型對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，注射分子探針90 min后，實(shí)驗(yàn)組（ZD2-Cy5）移植瘤明顯強(qiáng)化，對照組（CERAK-Cy5，非靶向性）移植瘤未見強(qiáng)化；180 min后實(shí)驗(yàn)組移植瘤信噪比是對照組的2倍；細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ZD2-Cy5與EDB-FN結(jié)合的特異性，為前列腺癌精準(zhǔn)診斷及非侵入性分子靶向顯影劑的開發(fā)提供了依據(jù)[31]。

在腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)中纖維連接蛋白沉積形成的纖維蛋白-纖連蛋白復(fù)合物被證實(shí)能促進(jìn)腫瘤增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移[32]；環(huán)肽CLT1能特異性地與腫瘤組織中形成的纖維蛋白-纖維連接蛋白復(fù)合物結(jié)合，而不與正常組織中形成的上述物質(zhì)結(jié)合[33]；Tan等[34]以纖維蛋白-纖維連接蛋白復(fù)合物為靶點(diǎn)，小肽CLT1為轉(zhuǎn)運(yùn)載體與Gd-DOTA納米粒2代結(jié)合，合成MR分子探針CLT1-G2-（Gd-DOTA）并對荷人前列腺癌PC-3裸鼠模型進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)。注射分子探針1 min后，實(shí)驗(yàn)組[CLT1-G2-（Gd-DOTA）]有100%信噪比增加，而對照組[KAREC-G2-（Gd-DOTA），非靶向性]僅有8%信噪比增加，表明小肽CLT1轉(zhuǎn)運(yùn)載體特異的靶向能力，為前列腺癌的診斷及治療后評估創(chuàng)造了條件。

3 展望

分子影像學(xué)是一個(gè)多學(xué)科交叉的科學(xué)。隨著人們對分子影像認(rèn)識的深入及納米生物技術(shù)、微流體技術(shù)等相關(guān)學(xué)科的快速發(fā)展，分子影像學(xué)也有了長足的進(jìn)步。作為分子影像學(xué)的重要組成部分，分子靶向顯像運(yùn)載體的開發(fā)應(yīng)用也取得了進(jìn)展。由于小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體分子量小，并具有良好的組織滲透性、代謝穩(wěn)定性和快速性及可耐受多種修飾等優(yōu)點(diǎn)，使其在轉(zhuǎn)運(yùn)載體的大家族中占有重要地位，對其研究及應(yīng)用越來越廣泛；然而，基于小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的靶向探針也面臨著一些問題，如代表性是否充分，與靶點(diǎn)結(jié)合效率情況，探針的重復(fù)性、細(xì)胞毒性等。隨著分子影像學(xué)及相關(guān)學(xué)科的發(fā)展和高性能小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的開發(fā)，預(yù)計(jì)將會(huì)逐步走向臨床應(yīng)用。

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R445.9

10.3969/j.issn.1005-5185.2017.04.018

2016-12-04

2017-02-21

（本文編輯 聞 浩）

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81460262）；海南省研究生創(chuàng)新科研課題項(xiàng)目（Hys2016-82）。

海南醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院 海南?？?570102

涂 蓉 E-mail: turong37472@126.com