張 蕾，宋婷婷

(1.浙江科技學院，浙江 杭州 310023； 2.浙江省農業(yè)科學院，浙江 杭州 310021)

昆蟲病原真菌遺傳改良研究進展

張 蕾1，宋婷婷2

(1.浙江科技學院，浙江 杭州 310023； 2.浙江省農業(yè)科學院，浙江 杭州 310021)

隨著現(xiàn)代遺傳學和分子生物學的快速進步，現(xiàn)代基因工程技術已發(fā)展成為改良菌株最常用且最有效的途徑，為昆蟲病原真菌的遺傳改良和選育高毒力殺蟲菌株開辟了新途徑。通過對昆蟲病原真菌的遺傳改良的研究進展的綜述，重點介紹了昆蟲病原真菌的篩選標記和以根癌農桿菌介導為代表的遺傳轉化體系，以及內源、外源基因的改造工程等的國內外研究現(xiàn)狀，進一步分析昆蟲病原真菌遺傳改良目前存在的問題及應用前景。

昆蟲病原真菌；遺傳轉化；基因改造工程；根癌農桿菌

作為控制自然界昆蟲種群數(shù)量的主要天然手段之一的昆蟲病原真菌，以之為主要成分制造的微生物殺蟲劑已被廣泛使用；但其在侵染寄主昆蟲過程中仍然受到高溫、紫外等環(huán)境因素的影響，同時還需克服寄主昆蟲體壁及免疫反應等一系列障礙，因此，昆蟲病原真菌傳統(tǒng)侵染時間較長。為提高其侵染效率，并加快其侵染速度，對其進行遺傳改良是現(xiàn)在國內外對昆蟲病原真菌基礎研究的主要領域。目前，常用的手段主要集中在通過誘變、細胞工程或基因工程3種技術方面的遺傳改良，但國內外大量研究證明，前兩種技術雖能達到遺傳改良的目的，但仍存在轉化效率低、目標性狀難把握等問題。隨著分子遺傳學的不斷發(fā)展，采用基因工程技術為菌株定向改良提供了最有效的途徑。

1 昆蟲病原真菌的篩選標記

昆蟲病原真菌常以大腸桿菌等細菌的質粒為基礎構建轉化載體。為檢測轉化后的表達情況，通常需要加入選擇性標記到載體上，而這個選擇性標記同時還具有確定轉化子及其遺傳特性的功能。通常在昆蟲病原真菌上使用的有兩類。一類是營養(yǎng)缺陷型互補基因，是通過轉入的標記基因與受體細胞缺陷基因互補，使受體細胞表現(xiàn)野生型生長而作為選擇標記的。目前，編碼色氨酸生物合成酶trp-1基因、粗糙脈孢菌trp-1基因的trp-C基因等都常被用作絲狀真菌的選擇性標記基因。另一類是抗性基因，將其轉入可以使受體細胞在一定的藥物濃度下生長，表現(xiàn)出藥物抗性[1-4]，包括苯菌靈(Benomyl)、博來霉素(Bleomycin)、寡霉素(Oligomycine)和潮霉素(Hygromycin)等，這其中抗性基因hph的相關報道最多[5-6]?？剐曰蚴秋@性選擇標記，使用十分方便，但這類抗生素卻對昆蟲病原真菌大多不敏感，無法用于其遺傳轉化。取而代之，粗糙脈孢霉(Neurosporacrassa)中抗苯菌靈的抗性基因即β-tubulin基因可用于金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)的遺傳轉化[7-8]，卻難用于球孢白僵菌(Beauveriabassiana)。而大量的研究證實，草丁膦抗性基因bar已成功應用于金龜子綠僵菌[9]、球孢白僵菌[10-11]和玫煙色擬青霉(Paecilomycesfumosoroseu)[12]。2010年，Zhang等[13]找到了一種新的昆蟲病原真菌分子標記，成功地將稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)中抗磺酰脲類除草劑的基因sur運用到白僵菌和綠僵菌的基因操作[14-18]中。

2 昆蟲病原真菌的遺傳轉化體系

昆蟲病原真菌的遺傳操作取決于高效轉化體系的建立。自1973年粗糙脈孢霉的DNA轉化方法[19]問世以來，通過生物、物理或化學等手段導入真菌基因組，以獲得外源基因穩(wěn)定遺傳和表達的真菌遺傳轉化體系研究越來越受到科研工作者重視。在經(jīng)歷了原生質體轉化法、芽生孢子轉化法、限制性內切酶介導轉化法(REMI)、基因槍法和電擊法等研究之后，通過借鑒植物細胞轉化的農桿菌介導的轉化法[11,20-22]，因其轉基因低拷貝、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點受到了人們廣泛關注。

目前仍被應用的經(jīng)典方法是1989年由Fincham[20]提出的基于原生質體的遺傳轉化，即聚乙二醇(PFG)為高分子多聚物，具有細胞黏合及擾亂細胞膜的磷脂雙分子層的作用，使得外源基因沉淀在受體的原生質體表面，并通過細胞內壓力推動的胞吐囊泡化而將外源基因吸入細胞體內[11,23]。可由菌絲[24]或芽生孢子制備原生質體[25]，此法具有易得到純合性轉化子等優(yōu)勢，但以原生質體為受體的基因轉化方法，同時也存在原生質體培養(yǎng)難度大、培養(yǎng)過程繁雜、培養(yǎng)工作量大、培養(yǎng)技術不易掌握、遺傳穩(wěn)定性差、再生頻率低，且再生周期長、轉化率低、效果不理想等劣勢。隨著分子生物學的發(fā)展，陸續(xù)出現(xiàn)如REMI法和電擊法等將外源基因導入正萌發(fā)的分生孢子[26]，基因槍轟擊可將外源基因直接轉入分生孢子[27]等以分生孢子或菌絲為受體的轉化方法。這幾種轉化方法因其步驟簡單，目前已廣泛應用到包括昆蟲病原真菌在內的完整細胞和原生質體的轉化，但仍存在轉化效率偏低、轉化子遺傳穩(wěn)定性較差[20，28]的問題。2006年醋酸鋰介導的芽生孢子轉化法[11,22]成功用于球孢白僵菌外源基因的導入[18，29-30]，操作容易且轉化效率較高，但僅局限于少數(shù)種類的昆蟲病原真菌。與其他真菌轉化體系相比，由根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的遺傳轉化理論機制最清楚，技術方法最成熟，應用也最廣泛，具有操作簡便、轉化受體不受限、轉化頻率高、能導入大片段的DNA、外源基因多以單拷貝插入且比例高、較少出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象及遺傳穩(wěn)定性好等優(yōu)點[31]，是目前用于昆蟲病原真菌基因操作的主要方法。

2.1 根癌農桿菌介導真菌的遺傳轉化

在真核微生物中，由根癌農桿菌介導的遺傳轉化方法最早于1995年用于酵母[32]，而1998年用于絲狀真菌[33]，再于1999年移植用于工業(yè)真菌，動植物病原真菌的遺傳轉化體系構建[34-37]。

與農桿菌介導植物遺傳轉化的機理相似，根癌農桿菌基于help質粒上一系列毒性基因(Vir基因)的表達產物將T-DNA導入昆蟲病原真菌細胞，但根癌農桿菌介導的真菌遺傳轉化[32-33]必須在乙酰丁香酮(acetosyingone，AS)等誘導表達多個Vir基因，如VirA、VirB、VirC、VirD1/D2、VirE和VirH等中的任何1個未發(fā)生突變，或完整的T-DNA左右兩側未發(fā)生缺失，轉化才會發(fā)生。

2.1.1 根癌農桿菌介導的遺傳轉化方式

由根癌農桿菌介導的昆蟲病原真菌遺傳轉化方式，T-DNA的整合主要有兩種模式。一種是在細胞核外可自由復制，并含有起始位點復制質粒(replicate plasmid)的T-DNA，且這類T-DNA一般不整合進染色體。與之相反，另一種T-DNA并不含起始位點復制質粒(integrative plasmid)，其進入宿主細胞后主要也有2種整合模式：當宿主染色體與T-DNA中存在同源序列，就會通過同源重組(homologous recombination)以單交換或雙交換方式整合進入基因組，即可實現(xiàn)同源重組[34]；但當宿主基因組與T-DNA中并沒有同源的片段，此時T-DNA將通過隨機的方式以非常規(guī)重組(illegitimate recombition)的形式整合進入基因組[38]。

2.1.2 影響根癌農桿菌介導真菌遺傳轉化的因素

影響根癌農桿菌介導的遺傳轉化效率或者說決定轉化成敗因素較多，主要有以下3個方面。

根癌農桿菌介導真菌轉化的關鍵是AS。研究證實[39-42]，在與受體細胞進行共培養(yǎng)時，若未用AS誘導，就無法獲得轉化子；且Tsuji等[43-44]研究表明，隨著AS濃度的增加，轉化效率也相應提高。也有研究認為，AS濃度增加到一定程度反而會降低轉化效率。對于根癌農桿菌在預培養(yǎng)時，是否需要AS的誘導作用仍存在爭議。Combier等[39]認為，預培養(yǎng)時AS的加入，在單拷貝插入的機率增加的同時反而降低了轉化頻率。但Leclerque等[44]則意見相左。

共培養(yǎng)的時間和溫度也是影響其轉化效率的關鍵因素之一。隨著共培養(yǎng)時間的延長，抗性轉化子也會產生越多。Combier等[39]在對粘花菇(Hebelomacylindrosporum)進行根癌農桿菌介導的真菌遺傳轉化時，共培養(yǎng)48 h獲得18個轉化子，當時間延長至96 h，其轉化子增至80個左右。球孢白僵菌進行根癌農桿菌介導的真菌遺傳轉化時，當共培養(yǎng)時間為3 h，其轉化效率是121個轉化子/106CFU；而當時間延長到4 h，其轉化效率提高至163個轉化子/106CFU[44]。Meyer等[41]研究表明，少于24 h或大于72 h的共培養(yǎng)時間都無法得到轉化子。Takahara等[42]則證實共培養(yǎng)時間過久反而會導致假陽性克隆的產生。同時，當共培養(yǎng)的溫度與受體最適宜的生長溫度一致時其轉化效率最高，降低或升高都降低了轉化子的數(shù)目[45]。

昆蟲病原真菌遺傳轉化的成敗和效率也會受到抗性標記、農桿菌、雙元載體及啟動子的選擇等影響。Hanif等[40]研究發(fā)現(xiàn)，在對乳牛肝菌(Suillusbovines)進行農桿菌轉化時，用腐草霉素抗性基因標記，轉化子中只有73%呈PCR陽性，而用潮霉素磷酸轉移酶(hygromycin B phosphotransferase)基因作為選擇標記，全部抗性轉化子均呈PCR陽性。在紅曲霉(Monascuspurpureus)的農桿菌轉化試驗中發(fā)現(xiàn)，利用雙元載體pUR5750比用pBGgHg的效率高出2倍，但當雙元載體換成pBG7-1時并未獲得轉化子[45]。在進行根癌農桿菌LBA4404轉化黑曲霉試驗中，當以雙元表達載體pBI121為骨架，并未得到轉化子[46]；但把根癌農桿菌菌株換成LBA1126，并以pbin19為基本骨架時轉化獲得成功[33]。另外Godio[47]研究證實，結構完全相同、2個啟動子部分不同的質粒會導致轉化時T-DNA單鏈結構的穩(wěn)定性不同而影響轉化結果。

2.2 昆蟲病原真菌的基因改造工程

為提高昆蟲病原真菌的毒力或抗逆等性狀，可高表達某些基因或抑制某些基因的表達，或者還可導入某些有用的外源基因，主要有以下兩個方面。

2.2.1 超表達或改造并超表達內源基因

昆蟲病原真菌一般由昆蟲體壁侵入其體內。研究證實，加快穿透昆蟲體壁的速度可提高真菌的毒力，而真菌在穿透昆蟲體壁時所分泌的降解酶，為基因工程改造真菌提供了目標基因來源，高表達這些基因就可提高體壁穿透速度。Leger等[48]通過高表達金龜子綠僵菌中Pr1類蛋白酶基因Prla來增強其毒力，使煙草天蛾(Manducasexta)的死亡時間縮短20%。組成性表達Prla基因不僅加快金龜子綠僵菌穿透寄主體壁的速度，且在血腔中表達的Pr1蛋白酶也會攻破寄主免疫防御系統(tǒng)，如酚氧化酶的過量表達就會加速寄主死亡等。方衛(wèi)國等[49]超表達幾丁質酶Bbchit1基因在球孢白僵菌內，對蚜蟲的致死濃度和致死時間都降低50%。同時，有些抗逆相關酶系也被證明與毒力密切關聯(lián)。超表達細胞質中的錳芯超氧化物歧化酶基因BbSod2，不僅可大幅提高球孢白僵菌的抗氧化和耐紫外的能力，同時也提高了對斜紋夜蛾(Spodopteralitura)二齡幼蟲的毒力[50]。目前，很多已知與毒力、抗逆相關的基因都有可能成為構建工程菌株的候選基因，如與胞內甘露醇調控相關的酶系[17，51]、抗氧化酶系[16，18]、調控抗逆性狀的若干信號傳導因子[14,16，52-53]以及甲酸可提取、被看成是孢壁結構成份的一些蛋白[30]。隨著金龜子綠僵菌、球孢白僵菌等重要昆蟲病原真菌全基因組測序的完成[54-55]，越來越多用于遺傳改良和工程菌株構建的基因資源正在被發(fā)掘。

研究證實，昆蟲病原真菌中的幾丁質酶和蛋白酶基因都具有提高毒力的作用，改造并超表達這些內源基因，均可以提升真菌的毒力。范艷華等[56-57]通過DNA shuffling和結構域融合技術對球孢白僵菌幾丁質酶Bbchit1和類枯草桿菌蛋白酶CDEP-1進行基因改良，轉基因結果表明其毒力顯著提高。

2.2.2 外源毒力或抗逆基因的導入

近幾年，通過高表達一些外源的昆蟲毒素基因來達到大幅提高該真菌毒力的目的，已逐漸發(fā)展成為昆蟲病原真菌遺傳改良的一個方向。將外源神經(jīng)毒素北非蝎毒素基因aaIT轉入金龜子綠僵菌表達并誘導其在寄主血腔中表達，證實該轉基因菌株對煙草天蛾(Manducasexta)幼蟲和埃及伊蚊(Aedesaegypti)雌成蟲的LC50分別降低22倍和9倍，LT50分別縮短30%和40%[23]，同樣此轉基因菌株對咖啡果小蠹(Hypothenemushampei)的毒力也大幅提高[58]。而在球孢白僵菌中轉入此毒素，也增強了對馬尾松毛蟲(Dendrolimuspunctatus)、大蠟螟(Galleriamellonella)的殺蟲功效，對2種蟲的LT50分別下降40%和24%[59]。進一步的研究證實，蝎毒素基因的導入正是利用昆蟲病原真菌通過體壁侵入寄主體內，從而在寄主血腔內表達毒素起到麻痹神經(jīng)而加速致死的作用。

研究證實，通過導入外源基因可大幅提高昆蟲病原真菌口服毒力，而轉基因工程菌可通過昆蟲取食而快速殺死鱗翅目暴食性害蟲。蘇云金芽孢桿菌是經(jīng)昆蟲口器攝入到達中腸后，通過破壞腸壁細胞從而引發(fā)壞血癥而起到殺蟲作用的，其能產生對鱗翅目、直翅目、鞘翅目等咀嚼式口器害蟲有胃毒殺活性[60-63]的殺蟲蛋白。秦毅等[29]在球孢白僵菌中組成性表達1種蘇云金芽孢桿菌腸毒蛋白基因Vip3Aa1，結果顯示，工程菌株BbV28對斜紋夜蛾二齡幼蟲的毒力大幅增強，第3天提高了17.2倍；王正亮等[64]通過優(yōu)化球孢白僵菌疏水蛋白基因的啟動子，并利用其超高表達Vip3Aa1基因，所得到的工程菌BbHV8的腸毒蛋白表達量比之前的秦毅等的工程菌BbV28提高近10倍，對斜紋夜蛾二、三齡的口服殺蟲效果大幅提高，而對BbV28不能有效毒殺的四、五齡蟲也能100%致死。這些研究證實，通過體壁侵染寄主的昆蟲病原真菌一般對蔬菜暴食性咀嚼式口器害蟲無能為力，但通過高表達某些毒蛋白，如腸毒蛋白的工程菌株，不僅可作用于這幾類害蟲的防治，且其原本具備的體壁侵染能力仍可協(xié)同對付刺吸式口器害蟲如蚜蟲(Aphidoidea)[65]、粉虱(Aleyrodidae)[66]、葉蟬(Cicadellidae)[67]、飛虱(Delphacidae)[68]、葉螨(Tetranychidae)[69]等。

導入外源基因除了提高真菌毒力之外，還可增強昆蟲病原真菌對環(huán)境脅迫的抵抗力，因此增強其對不利環(huán)境的適應能力與其在田間應用中的穩(wěn)定性有緊密的關聯(lián)。應盛華等[70]在球孢白僵菌中高表達大腸桿菌硫氧還原蛋白(trxA)基因，該轉基因菌在耐紫外輻射和48 ℃高溫的能力分別提高12%～16%和15%～17%的同時其抗氧化能力也顯著提高18%～20%。

3 昆蟲病原真菌遺傳改良存在的問題及展望

隨著基因操作技術的不斷發(fā)展，對昆蟲病原真菌進行基因操作和遺傳改良的研究近年來捷報頻傳，并顯示出良好應用前景。尤其是近幾年將腸毒蛋白VipAa1轉入球孢白僵菌、金龜子綠僵菌高表達的工程菌株，其對靶標害蟲的胃毒殺蟲活性和口服毒力為研制新一代雙途徑侵染的安全高效廣譜真菌殺蟲劑帶來了希望。但目前相關報道仍較為基礎，基因的篩選、改良及功能基因驗證仍有待于深入研究，以期為改造高毒力、高抗性的昆蟲病原真菌工程菌株提供理論依據(jù)。

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(責任編輯：張瑞麟)

2017-01-03

浙江省自然科學基金(LQ14C140005)

張 蕾(1981—)，女，浙江杭州人，副研究員，博士，研究方向為昆蟲病原真菌基因改造工程，E-mail：papaver_rhoeas@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170440

S433

A

0528-9017(2017)04-0679-06

文獻著錄格式：張蕾，宋婷婷. 昆蟲病原真菌遺傳改良研究進展[J].浙江農業(yè)科學，2017，58(4)：679-684.