張秀芬

（十堰市鄖陽區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖北十堰 442000）

獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)操作要點(diǎn)

張秀芬

（十堰市鄖陽區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖北十堰 442000）

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA) 用于很多試驗(yàn)中，在獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室中，利用該方式對(duì)疫病進(jìn)行檢測(cè)和診斷，具有高靈敏度、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)。本文重點(diǎn)分析獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)操作要點(diǎn)。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 獸醫(yī) 要點(diǎn)分析

1 前言

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）具備靈敏度高、操作簡(jiǎn)單和良好的特異性。ELISA被廣泛應(yīng)用于疫病免疫抗體檢測(cè)以及診斷中，但由于檢測(cè)過程中可能會(huì)出現(xiàn)較多的失誤，導(dǎo)致問題的出現(xiàn)，為進(jìn)一步控制ELISA準(zhǔn)確性，本文重點(diǎn)對(duì)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)操作要點(diǎn)進(jìn)行探究。

2 樣品基本知識(shí)

主要介紹樣品采集、處理以及保存的知識(shí)，ELISA測(cè)定樣品很多，如血清、尿液、唾液、排泄物等。部分樣品可直接開展ELISA檢測(cè)，比如血清；而部分則需要經(jīng)過預(yù)處理，比如糞便。獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室一般根據(jù)常規(guī)方式采集樣品。禽類采心臟、翅靜脈采血的方式。比如豬采前臂靜脈等處血；羊取頸靜脈血；牛頸靜脈、尾靜脈血。將血清分離時(shí)，避免出現(xiàn)溶血?，F(xiàn)階段，ELISA試劑盒多數(shù)使用的辣根過氧化物酶作為標(biāo)記，紅細(xì)胞溶解就會(huì)釋放出較多的過氧化酶活性物質(zhì)，在ELISA檢測(cè)中，溶血的會(huì)造成非特異性顯色，導(dǎo)致假陽性出現(xiàn)，最后很難得到精確的檢測(cè)結(jié)果。因此，采集來的血清樣品要在一定的時(shí)間內(nèi)完成檢測(cè)，確保血清的有效性。血清存于冰箱時(shí)間過長(zhǎng)，血清免疫球蛋白可能會(huì)出現(xiàn)聚合的情況，若5d內(nèi)完成的檢測(cè)血清樣品，要將至放于4℃環(huán)境中的；超過7d則要將之放于-20℃環(huán)境下存放。凍結(jié)血清樣品后，蛋白質(zhì)有局部濃縮不勻的現(xiàn)象出現(xiàn)，就要將之輕輕來回墊顛倒讓其充分混合，動(dòng)作幅度不宜過大。血清樣品反復(fù)冰凍對(duì)抗體有效性有影響，因此檢測(cè)抗體血清樣品要做幾次檢測(cè)；同時(shí)要確保血清的純度，不得有渾濁物在其中，避免假陽性反應(yīng)。

3 操作要點(diǎn)

3.1 加樣

加樣是試驗(yàn)結(jié)果的重要因素，選擇移液器方面，盡量選取與加樣量接近的移液器；盡量使用統(tǒng)一移液器，加樣姿勢(shì)一致。另外，取樣時(shí)，移液器槍頭要與取液板保持垂直，有利于液體體積平衡；與此同時(shí)，加樣時(shí)，槍頭與ELISA板孔保持垂直的，有助于將之加到板孔底部，過程中要仔細(xì)不要液體涂到孔壁上。最后，加不同加樣，要更換槍頭，避免發(fā)生交叉感染；而加樣量小，盡量的應(yīng)用倒退移液方法。

3.2 溫育

溫育是講抗原與抗體混合，在一定條件下進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)室一般在4℃、37℃以及43℃的情況下，開展ELISA反應(yīng)的溫育操作。溫育過程中，除了確保反應(yīng)溫度及時(shí)間，同時(shí)還要注意反應(yīng)樣品在溫育溫度下要快速達(dá)到平衡，一次不能增加太多反應(yīng)板疊塊在培養(yǎng)箱中。并根據(jù)ELISA規(guī)定的要求，室溫進(jìn)行溫育反應(yīng)，嚴(yán)格控制溫度，確保試驗(yàn)結(jié)果的精確度。試驗(yàn)中溫育的溫度與時(shí)間要嚴(yán)格控制，確保試驗(yàn)精確性，溫育避免發(fā)生有蒸發(fā)的情況，并采用的塑料貼紙或者是保鮮膜將板孔覆蓋，并將ELISA板放于濕盒內(nèi)部。

3.3 洗滌

ELISA試驗(yàn)時(shí)，洗滌主要是為了將吸附在反應(yīng)板上的污物，因此，洗滌效果對(duì)于ELISA試驗(yàn)結(jié)果是非常關(guān)鍵的作用。而洗滌過程中，試驗(yàn)操作人員要根據(jù)規(guī)定備好洗滌液，完成規(guī)定洗滌次數(shù)及，并于規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成。開展ELISA試驗(yàn)，可將浸泡時(shí)間加長(zhǎng)以及增加洗滌次數(shù)，有助于減少反應(yīng)本底讀數(shù)[1]。

3.4 顯色和比色

酶催化無色底物，并生成有色產(chǎn)物的這一過程即為顯色。出現(xiàn)顯色主要是受到顯色反應(yīng)溫度和時(shí)間。定性ELISA試驗(yàn)中，顯色于室溫即可開展，根據(jù)陰性、陽性對(duì)比孔顯色的情況及時(shí)對(duì)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行調(diào)整。但在ELISA試驗(yàn)中一定要按照的說明書進(jìn)行，確保顯色反應(yīng)的溫度和時(shí)間，保證得到有效的試驗(yàn)結(jié)果。酶標(biāo)儀器放于通風(fēng)、避免陽光照射處，儀器溫度保持在15℃～30℃范圍內(nèi)。比色前將酶標(biāo)儀預(yù)熱15～30min，保證測(cè)度結(jié)果。比色前，將底物對(duì)照孔和空白孔相關(guān)信息詳細(xì)登記，并將本次試驗(yàn)的試劑情況。每一次試驗(yàn)比色前使用潔凈吸水紙將板底液體吸凈。

4 規(guī)范操作要點(diǎn)措施

而在檢測(cè)的過程中，質(zhì)量控制極為關(guān)鍵，直接關(guān)系到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)質(zhì)量控制體系進(jìn)行建立與完善，使各項(xiàng)檢測(cè)操作能夠按照相關(guān)規(guī)定規(guī)范進(jìn)行。（2）不斷加大檢驗(yàn)人員的培訓(xùn)力度，提升其檢測(cè)技術(shù)與責(zé)任意識(shí)，使其能夠嚴(yán)格規(guī)范各項(xiàng)操作，規(guī)范應(yīng)用各項(xiàng)檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。（3）對(duì)試劑、質(zhì)量控制產(chǎn)品進(jìn)行合理選擇，保證其穩(wěn)定性與可靠性，并注重管理。（4）定期對(duì)室內(nèi)質(zhì)量控制情況進(jìn)行分析，總結(jié)其中失控的原因，如溫育時(shí)間與溫度控制不準(zhǔn)確、血清反復(fù)凍融等，及時(shí)對(duì)改進(jìn)、糾正的措施進(jìn)行制訂，以對(duì)ELISA檢測(cè)室內(nèi)質(zhì)量進(jìn)行有效控制[2]。

5 結(jié)語

在ELISA檢測(cè)中，開展監(jiān)測(cè)質(zhì)量控制是重要環(huán)節(jié)，是保證檢測(cè)精確性的關(guān)鍵。ELISA檢測(cè)的操作要點(diǎn)分析中包括加樣、洗滌、顯色和比色等內(nèi)容，開展ELISA試驗(yàn)，針對(duì)以上各要點(diǎn)，一定更要選取品質(zhì)優(yōu)良的ELISA試劑盒；并定期檢查移液器、溫箱、酶標(biāo)儀器等，試驗(yàn)過程中按照規(guī)定嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度、濕度；提升試驗(yàn)人員的操作試驗(yàn)的專業(yè)度?？傊?，要保證得到優(yōu)質(zhì)的ELISA檢測(cè)結(jié)果，就要選擇優(yōu)質(zhì)試劑、儀器并實(shí)施嚴(yán)格的操作，對(duì)保證和提升ELISA檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率具有十分重要的意義。

[1]杜敏，馬耀斌.淺析實(shí)驗(yàn)室常規(guī)ELISA檢測(cè)[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊，2016，5（12）：214.

[2]喬麗.淺談獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室工作幾點(diǎn)注意事項(xiàng)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘，2016，32（12）：148.