核磁共振氫譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合鑒別麥盧卡蜂蜜

近年來，麥盧卡（Manuka）蜂蜜由于其優(yōu)越的抑菌活性和特殊的口味在國(guó)際蜂蜜市場(chǎng)上獨(dú)樹一幟。麥盧卡樹是一種只生長(zhǎng)在新西蘭和澳大利亞部分地區(qū)的灌木，而麥盧卡蜂蜜主要產(chǎn)自新西蘭。據(jù)估算，目前全世界銷售的麥盧卡蜂蜜是新西蘭真實(shí)產(chǎn)量的3倍以上。由此可見，麥盧卡蜂蜜造假現(xiàn)象已非常嚴(yán)重。因此，迫切需要一種可靠的檢測(cè)體系來對(duì)麥盧卡蜂蜜進(jìn)行質(zhì)量控制。而目前在世界范圍內(nèi)已獲得廣泛認(rèn)可的蜂蜜摻假檢測(cè)技術(shù)是碳同位素方法檢測(cè)碳4植物糖。很顯然，這種方法并不適合麥盧卡蜂蜜的真?zhèn)舞b別。為此，法國(guó)學(xué)者Spiteri M.和新西蘭學(xué)者Rogers K.等合作，采用核磁共振氫譜（1H NMR）與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合的方法，對(duì)264個(gè)來自新西蘭和澳大利亞的蜂蜜樣品進(jìn)行分析研究，利用核磁共振氫譜鑒定了麥盧卡蜂蜜的核磁共振新標(biāo)識(shí)物-獨(dú)麥素（Leptosperin），并對(duì)Leptosperin、甲基乙二醛（MGO）和二羥基丙酮（DHA）進(jìn)行量化，建立偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）模型來鑒別麥盧卡蜂蜜，取得良好的效果，其正確率達(dá)89%。

DHA和MGO作為麥盧卡蜂蜜的標(biāo)識(shí)性物質(zhì)，其中DHA在成熟和貯藏過程中不斷地轉(zhuǎn)變?yōu)镸GO，MGO則是麥盧卡蜂蜜強(qiáng)抑菌活性的主要因素。之前也有學(xué)者從成分角度去鑒別麥盧卡蜂蜜和其他蜂蜜的研究，但方法較為復(fù)雜，往往需要結(jié)合多個(gè)技術(shù)同時(shí)進(jìn)行。Spiteri M.等利用獨(dú)立成分分析（ICA）確定蜂蜜樣品的鑒別信號(hào)：在2.30 ppm和1.38 ppm處分別出現(xiàn)兩個(gè)MGO的獨(dú)立信號(hào)峰，在4.41 ppm處出現(xiàn)一個(gè)DHA信號(hào)源。驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，麥盧卡蜂蜜確實(shí)含有較高的MGO和DHA，但非麥盧卡蜂蜜中也含有部分的DHA和MGO，這可能是由于蜜蜂采集多種花蜜導(dǎo)致蜂蜜不純所致。由于MGO和DHA可以人為添加，因此需要尋找其他信號(hào)來提升準(zhǔn)確度。研究發(fā)現(xiàn)，在芳香區(qū)7.42 ppm處發(fā)現(xiàn)的單峰與MGO和DHA相關(guān)性很高。將這個(gè)特征峰與3,4,5-三甲氧基苯甲酸和丁香酸甲酯這兩種物質(zhì)的峰進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們并不匹配。猜測(cè)此峰也許是2012年就被Kato等人報(bào)道過的麥盧卡蜂蜜特征標(biāo)志物L(fēng)eptosperin的變形峰。于是，他們利用核磁共振氫譜分析Leptosperin后，在7.34 ppm處發(fā)現(xiàn)一個(gè)單峰，但與之前不同的是，此時(shí)溶解蜂蜜的溶劑是甲醇而不是水。驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，圖譜的化學(xué)位移的確與溶劑有關(guān)。隨后，他們通過核磁共振量化Leptosperin，發(fā)現(xiàn)與2014年Kato等人通過超高液相色譜（UPLC）獲得的值保持高度一致；利用液相色譜和飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（LC-TOF）找到與Leptosperin對(duì)應(yīng)的化合物；進(jìn)一步將通過核磁共振氫譜進(jìn)行量化的DHA和MGO值與高效液相色譜（HPLC）值比較，發(fā)現(xiàn)它們的相關(guān)系數(shù)分別高達(dá)0.99和0.98，表明核磁共振可準(zhǔn)確量化這三種關(guān)鍵成分。

他們利用核磁共振氫譜對(duì)84種麥盧卡單花蜜和183種其他類型單花蜜的三種關(guān)鍵成分進(jìn)行量化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，麥盧卡蜂蜜的DHA均值為1154 mg/kg，95%范圍為50～2515 mg/kg；非麥盧卡蜂蜜的DHA均值為347 mg/kg，95%范圍為0～1332 mg/kg。麥盧卡蜂蜜的MGO均值為672 mg/kg，95%范圍為18～1555 mg/kg；非麥盧卡蜂蜜的MGO均值為233mg/kg，95%范圍為0～940 mg/kg。麥盧卡蜂蜜的Leptosperin均值為784 mg/kg，95%范圍為62～1556 mg/kg；非麥盧卡蜂蜜的Leptosperin均值為394 mg/kg，95%范圍為0～980 mg/kg。雖然麥盧卡蜂蜜與非麥盧卡蜂蜜均值和范圍存在明顯差異，但依然有一些重疊部分，這可能是蜂蜜純度不夠造成的。因此，在模型建立之前，剔除100個(gè)卡努卡（Kanuka）、卡馬希（Kamahi）和麥盧卡混合蜜的樣品值以及45個(gè)離群值，一共122個(gè)樣品參與建模。從中隨機(jī)選擇104個(gè)蜂蜜樣品（85%）作為訓(xùn)練集，18個(gè)樣品（15%）作為檢測(cè)集，用于模型驗(yàn)證，從而建立一個(gè)PLSDA模型，用以鑒別麥盧卡蜂蜜和其他蜂蜜。

該研究利用核磁共振氫譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)了麥盧卡蜂蜜新的核磁共振標(biāo)識(shí)物L(fēng)eptosperin，是一項(xiàng)重大的突破。而且，該研究的樣本量較大且均通過多種方法進(jìn)行驗(yàn)證，較好的重現(xiàn)性和特征性表明，核磁共振氫譜方法具有較高的可行性和可靠性。利用這種方法鑒定和量化麥盧卡蜂蜜的三個(gè)特征性標(biāo)識(shí)物，不僅快速高效而且成本較低；再者，該技術(shù)既可明確鑒別是否存在麥盧卡蜂蜜，也可鑒別麥盧卡純蜜和混合蜜，這有助于解決新西蘭蜂蜜和澳大利亞蜂蜜混合摻假問題。同時(shí)，這一方法值得我們?cè)谄渌涿圪|(zhì)量控制研究中加以借鑒。

浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院思娟娟胡福良編譯