郭建紅，蔡 穎，吳松浩

（汕頭出入境檢驗檢疫局，廣東汕頭 515041）

羅湖病毒研究進展

郭建紅，蔡 穎，吳松浩

（汕頭出入境檢驗檢疫局，廣東汕頭 515041）

2009年以來，以色列、厄瓜多爾和埃及等國相繼暴發(fā)養(yǎng)殖和野生羅非魚大量死亡事件。直到2014年，才發(fā)現(xiàn)其致病病原是新型RNA病毒——羅湖病毒。本文介紹了羅湖病毒的幾次流行情況及其臨診癥狀，包括以色列、厄瓜多爾、埃及等國家發(fā)生的羅非魚大量死亡事件，以及厄瓜多爾養(yǎng)殖羅非魚死亡事件中的初步病原學研究、羅湖病毒的發(fā)現(xiàn)和首次命名、病毒的基因組特征研究、厄瓜多爾死魚事件的再次研究、埃及羅非魚檢出羅湖病毒陽性等，并結合該病毒的特點提出了防治建議。

羅非魚；羅湖病毒；研究進展

羅非魚是全球重要淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚種之一，可進行高密度養(yǎng)殖，是動物性蛋白質的重要來源。聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織（FAO）數(shù)據(jù)顯示，2012年全球養(yǎng)殖羅非魚產量為456萬噸，到2013年達到489萬噸，到2014年達到531萬噸。我國是全球羅非魚的最大生產國，2013年產量166萬噸；2014年產量155萬噸，其中出口41萬噸；2015年產量165萬噸，其中出口42萬噸；2016年產量保持在160多萬噸。2013和2014年我國羅非魚產量分別占據(jù)世界總產量的34%和29%。

與其他魚類比較，羅非魚曾經(jīng)以易養(yǎng)殖和抗病力強著稱。然而，近年來以色列、厄瓜多爾和埃及等國相繼暴發(fā)的與病毒有關的養(yǎng)殖和野生羅非魚大量死亡事件，給這些國家的羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成了重大損失。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)引起這些死魚事件的病原均為羅湖病毒（Tilapia lake virus，TiLV），是一種新型魚RNA病毒。

1 羅湖病毒的流行情況和臨診癥狀

1.1以色列全國發(fā)生羅非魚大量死亡事件

2009年夏天，以色列在全國范圍內陸續(xù)發(fā)生養(yǎng)殖場和野生羅非魚大量死亡事件。以色列基內雷特湖（也稱為加利利海）的野生羅非魚和國內養(yǎng)殖場的養(yǎng)殖羅非魚突然大量死亡，死亡率高達70%?；鶅壤滋睾_非魚產量從2005年的316噸，下降到2007年的51噸、2009年的8噸和2010年的45噸[1]。

羅非魚大量死亡事件發(fā)生在天氣炎熱的5—10月期間，其特點主要有以下三點：一是病毒擴散是從一個養(yǎng)殖池到另一個養(yǎng)殖池，波及不同生長期階段的羅非魚；二是發(fā)病和死亡僅限于尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）與奧利亞羅非魚（Oreochromis aureus）雜交產生的羅非魚品種，與羅非魚一起養(yǎng)殖的鯉魚和鯔魚沒有發(fā)現(xiàn)與羅非魚一樣的發(fā)病癥狀；三是一次羅非魚集中死亡之后，同一魚池不會再有大量魚死亡的事件發(fā)生[1]。

病魚體色發(fā)黑，體表有潰爛，眼睛有明顯的病變，發(fā)病前期晶狀體渾濁，后期晶狀體破裂發(fā)炎，眼睛內容物濃縮，失去正常視覺功能。羅非魚大量死亡的原因不明，常規(guī)的寄生蟲監(jiān)測、細菌監(jiān)測、病毒監(jiān)測和毒素監(jiān)測均未見異常[1]。

1.2厄瓜多爾養(yǎng)殖羅非魚大量死亡事件

2011年，厄瓜多爾發(fā)生羅非魚大量死亡事件。出現(xiàn)羅非魚大量死亡的養(yǎng)殖場中，本場培育的Chitralada品系羅非魚苗大量死亡，而從其他養(yǎng)殖場引進的尼羅羅非魚大部分沒有感染。魚苗轉入育成池4～7 d后開始出現(xiàn)死亡。被感染的魚池中，Chitralada品系羅非魚存活率僅為20%，而尼羅羅非魚的存活率達到80%。病魚一般表現(xiàn)消瘦，體表發(fā)黑，腹部膨脹有積水，魚鱗突出，眼球突出[2]。

1.3埃及養(yǎng)殖羅非魚大量死亡事件

2012—2016年的夏季，埃及當?shù)厮疁剡_到25℃以上，羅非魚主要產區(qū)的中、大規(guī)格尼羅羅非魚每年出現(xiàn)不明原因的大量死亡，稱為“夏季死魚事件”，其中2015年損失產量估計約98 000噸（價值1億美金）。對埃及羅非魚主產區(qū)的68個養(yǎng)殖場進行調查表明，37%的養(yǎng)殖場（25個）發(fā)生了“夏季死魚事件”，平均死亡率為9.2%（死亡率波動區(qū)間為5%～15%）。發(fā)病率最高的是放養(yǎng)密度高的養(yǎng)殖場和大型養(yǎng)殖場；其次是小型養(yǎng)殖場、鯔魚和羅非魚混養(yǎng)場（鯔魚15%和羅非魚85%）；發(fā)病率最低的是單品種養(yǎng)殖的養(yǎng)殖場。38個僅養(yǎng)殖羅非魚的養(yǎng)殖場中，有3個養(yǎng)殖場發(fā)病，而30個混養(yǎng)的養(yǎng)殖場中，有22個養(yǎng)殖場發(fā)病。病魚表現(xiàn)體表淺層出血、發(fā)炎、水腫等癥狀[3]。

2 羅湖病毒研究進展

2.1厄瓜多爾養(yǎng)殖羅非魚死亡事件中的初步病原學研究

Ferguson等[2]對厄瓜多爾養(yǎng)殖羅非魚大量死亡事件進行了調查和研究。在2011年5月（氣溫27 ℃）、7月（氣溫25 ℃）、11月（氣溫25 ℃）和2012年5月（氣溫27 ℃），采集Chitralada品系病魚樣品進行病理切片結果顯示，肝臟和胃腸道為主要病變器官。肝臟壞死、發(fā)炎并出現(xiàn)合胞體；胃腺壞死；腸腔中形成蛋白管型；肝細胞質和部分合胞體細胞中，有明亮色嗜曙紅細胞或棕色脂蛋白樣沉積物。這些沉積物從1～2 mm到5～6 mm不等。超微結構觀察顯示，合胞體有3～4個細胞核以上，多的有15～20個細胞核。膽管雖然鄰近肝細胞壞死部分，但大部分沒有病變，一些嚴重病魚的肝外胰腺也沒有病變。在肝病變的情況下，肝細胞和狄氏腔中出現(xiàn)大量病毒樣顆粒，顆粒直徑60～70 nm。這些病毒樣顆粒單個存在或聚集成小團，附著在粗面內質網(wǎng)表面。其細胞質和細胞核中均未發(fā)現(xiàn)大的病毒序列或集合。因此，未發(fā)現(xiàn)導致羅非魚死亡率異常增高的原因，根據(jù)現(xiàn)有證據(jù)只能推測可能是由病毒引起的。雖然發(fā)病機理尚不清楚，但從全身水腫和組織病理切片檢查結果來看，存在蛋白丟失性腸病。肝的嚴重病變可能危及血漿蛋白的合成；胃腸道的病變可能導致腸道養(yǎng)分攝取縮減和蛋白丟失，接下來腸道的細菌定植可能導致吸收內毒素。如果魚感染了急性系統(tǒng)性疾病，尤其是病毒性疾病，胃腸道的嚴重病變肯定會導致食欲減退。但由于死魚太小，無法進行血液化學檢測，因此無法確定死魚是否因出現(xiàn)低蛋白血癥而導致死亡。由于這是一種新的魚病，稱之為羅非魚合胞肝炎病毒（Syncytial hepatitis of tilapia，SHT）。

2.2羅湖病毒的發(fā)現(xiàn)和首次命名

2014年，Marina Eyngo等[1]研究發(fā)現(xiàn)，導致以色列羅非魚大量死亡的病原體是一種新型RNA病毒，同時建立了病毒分離和RT-PCR鑒定方法，但未進行物種分類。由于最早發(fā)現(xiàn)該病毒所致死魚事件的地點為基內雷特湖（Kinneret Lake），將該病毒命名為羅湖病毒（Tilapia lake virus，TiLV）。將發(fā)生病變的病魚器官勻漿，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，分別與8種不同的細胞系進行共孵育，未發(fā)現(xiàn)任何已知的病原體，但發(fā)現(xiàn)該病毒能引起羅非魚原代腦細胞或E-11細胞系的細胞病變效應（CPE），分別在共孵育后10～12 d、5～7 d后出現(xiàn)明顯的CPE現(xiàn)象。前者表現(xiàn)為細胞由細長變腫脹、變圓，有顆粒形成，后者表現(xiàn)為胞漿空泡、蝕斑形成。在本研究所有不同來源的25個病魚樣品中，均觀察到了相同的CPE現(xiàn)象。產生CPE的培養(yǎng)物上清液與正常的健康細胞共孵育，也能出現(xiàn)同樣的CPE現(xiàn)象。電子顯微鏡顯示，病毒有包膜，直徑為55～75 nm。病理學檢查發(fā)現(xiàn)，病魚出現(xiàn)失去活力、視覺變化和皮膚腐蝕等典型癥狀，死亡率超過80%。內臟（腎和腦）出現(xiàn)充血的組織變化，伴隨膠質灶和大腦皮質層淋巴細胞血管周圍聚集。眼部發(fā)炎，包括眼內炎和晶體白內障化。肝脾細胞的直接損傷似乎不明顯，肝實質偶有出現(xiàn)隨機分布的細胞腫脹、澄清，胞質內出現(xiàn)黃色至棕色的顆粒狀色素；脾增生，橢圓體周圍出現(xiàn)增生的淋巴細胞，但肝脾中黑色素巨噬細胞中心（MMCs）數(shù)量增多、體積變大，表明病魚處于嚴重感染后期的慢性感染階段。給健康羅非魚腹腔注射出現(xiàn)CPE的細胞培養(yǎng)物的上清液，會導致出現(xiàn)類似自然染病的癥狀。這些出現(xiàn)癥狀的病魚中，又能再次分離到TiLV，也能再次感染健康魚，符合科赫法則，證明了本研究分離的TiLV確為死魚事件的病原體。健康魚腹腔注射，10 d內的死亡率為75%～85%。當病魚與健康魚混養(yǎng)時，健康魚也出現(xiàn)同樣的疫病，死亡率與腹腔注射的類似，但死亡率動力學略有延遲，證明疾病可以通過水源性傳播。感染疾病后幸存的魚，對TiLV具有免疫力，表明產生了保護性的免疫應答。通過cDNA篩選文庫法確定了TiLV（克隆7450）特異性序列（GenBank索引號KJ605629），長1 326 bp，其中包含1個編碼420個氨基酸的開發(fā)讀碼框，在GenBank的核酸序列和蛋白質序列數(shù)據(jù)庫中均未發(fā)現(xiàn)同源性序列，建立了RT-PCR診斷測試方法。

2.3TiLV的基因組特征研究

2016年，Eran Bacharach等[4]采用無偏倚高通量測序、Northern雜交、質譜分析、原位雜交、感染性研究等方法發(fā)現(xiàn)，導致以色列羅非魚大量死亡的TiLV是正粘病毒樣病毒，為RNA單股負鏈病毒，由10個獨特的基因片段組成，各片段大小分別為1.641 kb、1.471 kb、1.371 kb、1.250 kb、1.099 kb、1.044 kb、0.777 kb、0.657 kb、0.548 kb和0.465 kb。最大的第1片段包含1個開放閱讀框，與C型流感病毒PB1有弱同源性。其他9個片段在GenBank中未發(fā)現(xiàn)與任何核酸、蛋白同源序列。10個片段中，在5′和3′末端均發(fā)現(xiàn)有長度為13個核苷酸的保守序列，與流感病毒、ISA病毒、瑟高特病毒等正粘病毒的基因結構特征一致，其中有10個核苷酸為100%保守，另外3個核苷酸在5、9片段上完全一致，而且5′和3′末端的序列呈現(xiàn)互補的特點。質譜分析顯示，片段2～10中均含有開放讀碼框（ORFs），編碼多肽，而片段1中則未檢測到多肽編碼序列，片段5、6均含有信號肽間隙位點。高通量測序和序列分析顯示，厄瓜多爾死魚事件中檢出的TiLV PCR陽性樣品與以色列樣品中獲得的核酸序列有97.20%～99.00%相同，相應編碼區(qū)對應的氨基酸序列有98.7%～100%相同。原位雜交顯示，TiLV在發(fā)病羅非魚的肝和中央神經(jīng)系統(tǒng)的病變部位復制和轉錄。從以色列和厄瓜多爾死魚事件中病魚的肝、腦病灶中均發(fā)現(xiàn)病毒核酸，同時觀察到由病魚組織分離到的TiLV在培養(yǎng)細胞中繁殖后，接種到健康魚體內后，可產生相同癥狀的疾病，提示TiLV為以色列和厄瓜多爾死魚事件的病因。地理上分散的2個地方均出現(xiàn)由TiLV導致的大規(guī)模死魚事件，說明該病毒已經(jīng)對羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成了全球性威脅。

2.4厄瓜多爾死魚事件的再次研究

2016年，del-Pozo等在前期關于“羅非魚合胞肝炎”相關病毒報道描述其臨床表現(xiàn)、組織病理學和超微結構變化的基礎上，采用透射電鏡、RT-PCR技術對該病毒開展進一步研究。透射電鏡發(fā)現(xiàn)，該病毒特征與以前報道的TiLV相似，而且具有一些與正粘病毒類似的特征：胞內外均有60～100 nm帶3層衣殼的圓形病毒子，組成多達7個電子致密的聚合體；有體現(xiàn)內吞作用的折疊狀、絨毛狀的病毒子。但合胞形成以及出現(xiàn)的胞質內游離病毒子等特征，卻是流感病毒和ISA（傳染病性鮭魚貧血?。┎《镜日巢《舅痪邆?。另外，其病毒子出現(xiàn)在肝細胞，不出現(xiàn)在內皮細胞的嗜組織特性，與流感病毒和ISA病毒不同。因此，推斷該病毒應該是新型的正粘病毒，但仍需要進行基因組測序，以明確其分類學地位。RT-PCR結果顯示，此病毒與此前報道的TiLV有部分基因同源性（190 nt），另有其他相關研究也證明了其同源性。雖然，SHT相關病毒與TiLV的嗜組織特性、病魚外觀表現(xiàn)、組織病理學特征、發(fā)病進程等方面表現(xiàn)出差異，但由于2種病毒的基因同源性已經(jīng)證實，因此它們之間的關系還需進一步深入研究。另外，病毒分離、傳播、復制、致病機理等是下一步需要研究的問題。

2.5埃及羅非魚檢出TiLV陽性

許多專家對被稱為“夏季死魚事件”的疾病進行了研究，試圖找出病原體，但都沒有結論。曾有研究表明，埃及養(yǎng)殖羅非魚大量死亡可能與維羅納氣單胞菌溫和型變種有關，但未證實為主要原因。

2017年，Mohamed Fathi等[3]發(fā)現(xiàn)，對7個發(fā)生“夏季死魚事件”的埃及養(yǎng)殖場采集的樣品，采用RT-PCR方法進行TiLV檢測，其中3個樣品陽性，這是在埃及第1次檢測到TiLV。TiLV序列分析顯示，其與以色列發(fā)現(xiàn)的TiLV基因序列存在93%的同源性。組織病理學研究顯示，PCR陽性病魚出現(xiàn)多病灶的神經(jīng)膠質細胞增生、腦炎和輕度的腦部血管周圍淋巴細胞套狀聚集、輕度腦膜炎、輕度血管周圍多病灶慢性肝炎、腎臟多病灶間質出血、表皮中度斷裂、表面出血、炎癥和水腫。該項研究未從樣品中分離出病毒。Mohamed Fathi等認為，仍需要在流行病學和實驗感染等方面進一步研究，以證實TiLV是否是“夏季死魚事件”的主要病因。

3 總結和展望

經(jīng)過多年的不懈研究，科學家們確定以色列、厄瓜多爾和埃及等國相繼暴發(fā)的養(yǎng)殖和野生羅非魚大量死亡事件，其病原均為一種新型的單鏈RNA病毒，并以其最早發(fā)現(xiàn)地基內雷特湖（Kinneret Lake）來命名，稱為羅湖病毒（TiLV）。以色列和埃及兩國相鄰，但另一個地理上相隔甚遠的南美國家厄瓜多爾也發(fā)生了由同種病毒引起死魚事件，說明該病毒已經(jīng)對全球性羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成了威脅。為了減少損失，考慮到不同種的羅非魚對TiLV的易感性不同，可以在養(yǎng)殖品種方面進行選擇，避免養(yǎng)殖易感品種。另外，養(yǎng)殖場要加強生物防治措施，要實施到位，還要加強魚苗檢疫監(jiān)測，加強魚場管理和消毒。部分羅非魚在感染TiLV后能存活下來，說明存在針對病原的免疫應答，應盡快研制出TiLV疫苗。

[1] EYNGOR M，ZAMOSTIANO R，TSOFACK J E K，et al. Identification of a novel RNA virus lethal to Tilapia[J]. Journal of Clinical Microbiology，2014，52（12）：4137-4146.

[2] FERGUSON H W，KABUUSU R，BELTRAN S，et al. Syncytial hepatitis of farmed tilapia，Oreochromis niloticus：a case report[J]. Journal of Fish Diseases，2013，37（6）：583-589.

[3] FATHI M，DICKSON C，DICKSON M，et al. Identification of Tilapia lake virus in Egypt in Nile tilapia affected by ‘summer mortality′ syndrome[J]. Aquaculture，2017，473：430-432.

[4] BACHARACH E，MISHRA N，BRIESE T，et al. Characterization of a novel orthomyxo-like virus causing mass die-offs of Tilapia[J]. Mbio，2016，7（2）：e00431.

（責任編輯：杜憲）

Research Progress in Tilapia Lake Virus

Guo Jianhong，Cai Ying，Wu Songhao
（Shantou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Shantou，Guangdong 515041）

Since 2009，episodes of significant mortality of cultured and wild Tilapia were recorded in Israel，Ecuador，Egypt and other countries. Until 2014，it was found that the causative agent was the new RNA virus，Tilapia lake virus（TiLV）. Several times of TiLV prevalence and its clinical symptoms were introduced in this paper，including a lot of Tilapia deaths in Israel，Ecuador，Egypt and other countries，preliminary etiological study of dead tilapia in Ecuador，the discovery and fi rst nomenclature of the TiLV，genome characterization of viruses，a re-study of the dead fi sh incident in Ecuador，Tilapia detected positive for TiLV in Egypt，and so on.The control suggestions were put forward according to the characteristics of the virus.

Tilapia；Tilapia lake virus（TiLV）；research progress

Q939.47

A

1005-944X（2017）08-0072-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.08.020